Анализ микобиоты в пораженных листьях картофеля (Solanum tuberosum L.) с использованием метагеномных подходов

Проблема поражения картофеля заболеваниями, вызванными грибами и грибоподобными организмами, актуальна для всех регионов мира, где возделывается эта культура, поскольку именно они наносят растениям самый значительный ущерб (A. Bernreiter, 2017). Традиционные подходы для идентификации патогенов картофеля нацелены на детекцию конкретного патогена и не учитывают ни другие (часто неизвестные) патогены, ни полезную микробиоту филлосферного сообщества, нарушения которой также могут стать одной из причин заболеваний. В нашей работе впервые исследована патогенная и непатогенная грибная и грибоподобная микрофлора с применением метагеномного подхода. Впервые показано, что реальная картина имеет комплексный и не вполне однозначный характер (например, основной патоген может быть минорным компонентом всего сообщества). Таксономический анализ сообществ, полученных по обоим вариантам праймеров, выявил в образце с поражением типа альтернариоз патогенный гриб рода Alternaria . Использование праймеров для амплификации региона ITS1 позволило обнаружить наличие оомицета Phytophthora и диагностировать присутствие фитофторы при обоих типах поражения. Целью нашей работы была максимально полная идентификация видового состава грибов и грибоподобных организмов, участвующих в фитопатогенезе листьев картофеля, с применением высокопроизводительного секвенирования и двух вариантов универсальных праймеров. Для анализа сообществ из образцов листьев картофеля сорта Никулинский, пораженных заболеваниями альтернариозного и фитофторозного типов, выделили ДНК, которую в дальнейшем использовали для создания ампликонных библиотек фрагментов ITS1 и ITS2 и высокопроизводительного секвенирования на приборе Illumina MiSeq («Illumina, Inc.», США). В процессе биоинформатической обработки данных при помощи программного обеспечения Illumina и программного пакета PIPITS (H.S. Gweon с соавт., 2015), получили 187 ОТЕ (операционные таксономические единицы) и 113 филотипов для библиотеки ITS1, 249 ОТЕ и 127 филотипов для ITS2. Последующее аннотирование ОТЕ и таксономический анализ сообществ проводились в программе QIIME (J.G. Caporaso с соавт., 2010), коэффициенты разнообразия внутри сообщества рассчитывались при помощи программного пакета PAST (Ø. Hammer с соавт., 2001). Сравнительная характеристика сообществ грибов и грибоподобных организмов, полученных для обоих видов поражения с использованием различных универсальных праймеров для ITS1 и ITS2, показала, что из выбранных праймеров только первая пара подходит для детекции фитофторы и дает более выравненную картину сообщества. Инструментов автоматического аннотирования результатов секвенирования оказалось недостаточно для объективной идентификации альтернарии в образцах, в связи с чем мы использовали методы ручного поиска по последовательностям в программе BLASTn (S.F. Altschul с соавт., 1990). Поскольку пара праймеров для ITS2 не учитывала присутствие фитофторы в образцах, дальнейший сравнительный анализ сообществ, характерных для двух типов поражения, проводился с использованием данных только по библиотеке ITS1. Результаты таксономического анализа показали, что на пораженных участках при обоих типах патогенеза формировалось довольно богатое сообщество грибов и грибоподобных организмов, причем в случае с поражением по типу фитофтороза доля соответствующего патогена в сообществе составляет около 30 %, а в варианте с альтернариозом - всего 2,07 %, тогда как значительная часть (около 15 %) приходится на фитофтору, что не исключает так называемого вторичного поражения. Таким образом, в сообществах, сформировавшихся на участках, пораженных заболеванием, доля патогенов составляет не более 30 %, что свидетельствует о выраженной динамике таксономического состава в зоне поражения. Очевидно, что методы высокопроизводительного секвенирования имеют весьма высокий потенциал в фундаментальных и прикладных исследованиях заболеваний растений, имеющих микробиологическую природу.