Анализ микробных сообществ термальных источников района озера Фумарольное Кальдеры вулкана Узон, Камчатка

типами анаэробного дыхания (серо-, нитрат- и железоредукторам, использующим СО), тогда как другие группы микроорганизмов, например, использующие в своем метаболизме метан и/или другие С 1 соединения, исследованы крайне недостаточно. Основные микробиологические исследования выполнены на объектах, расположенных на Восточном термальном поле, а изучение микробных сообществ в термальных источниках района озера Фумарольное практически не проводились. В то же время образование горячих озер на месте кратероподобных воронок является уникальной особенностью Узонских термопроявлений. Крупнейшим среди них является озеро Фумарольное, которое заполняет обширную котловину размером 300 х 600 м с хорошо выраженным береговым обрывом.

Цель исследования: изучение микробного разнообразия в термальных источниках района озера Фумарольное кальдеры вулкана Узон (Камчатка) с помощью методов молекулярной экологии. Особое внимание было уделено мета-нокисляющим организмам, сведения о которых практически отсутствуют.

Материалы и методы.

Отбор образцов и определение физикохимических параметров среды. Образцы цианобактериальных матов и ила были отобраны в ходе экспедиционных исследований в июле 2010 г. Определение физико-химических параметров гидротерм (температуры, pH, Eh) производили с помощью наборов Aquamerk («Merck», Германия). Результаты представлены в табл. 1. Непосредственно на месте отбора 2 см3 образца вносили во флаконы объемом 120 мл с 20 мл среды «П» [3], разбавленной в 5 раз, и инкубировали в атмосфере метан: воздух (1:1) в течение 7 суток в источнике Заварзина (56,7оС). Полученные обогащенные образцы (первичная накопительная культура) были использованы в лаборатории для проведения исследований методами ПЦР и FISH, а также для выделения накопительных культур метано-трофов.

Выделение ДНК и ПЦР-детекция прокариот различных таксономических и функциональных групп. Препарат тотальной ДНК выделяли с помощью коммерческого набора реактивов (Wizard Genomic DNA Purification Kit, «Prome-ga», США) в соответствии с протоколом производителя с минимальными модификациями. Для увеличения выхода микробной ДНК мы проводили обработку лизирующим буфером при повышенной температуре (80^оС) и встряхивании. Для амплификации фрагментов рибосомального гена 16S рРНК бактерий использовали систему праймеров 341 F-907 R [4], для архей – 344F-915R [5]. Для детекции прокариот различных функциональных групп (метанотрофы, фотосинтетики, метаногены, нитрификаторы) использовали ПЦР-амплификацию фрагментов генов ключевых ферментов различных процессов метаболизма. Для метанотрофов применяли систему вырожденных праймеров А189F и A682R [6], амплифицирующих фрагмент гена pmoA , кодирующего синтез β-субъединицы метанмонооксигеназы (ММО), ключевого фермента метанокис-ления, а для обнаружения прокариот, обладающих генами автотрофной фиксации углекислоты в цикле Кальвина ( cbbL ) применяли праймерную систему cbbl1F- cbbLR [7].

Присутствие метаногенных архей детектировали с помощью праймерной системы mcrAF /mcrAR [8], позволяющей амплифицировать фрагмент гена mcrA, кодирующего α-субъеди-ницу фермента метил-коэнзим М, а нитрифицирующих архей – праймерной системой Crena-moA23f и CrenamoA616 [9] для детекции фрагмента amoA архей. Оценку разнообразия метано-трофов проводили методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с использованием праймера A189F(GC) с GC-клампом для обеспечения разделения смеси ампликонов pmoA в полиакриламидном геле [10]. Состав реакционной смеси для ПЦР и температурно-временной профиль реакции соответствовали таковым в упомянутых выше работах. Амплификацию проводили на приборе MyCycler («BioRad», США). Анализ продуктов ПЦР проводили в 1,2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Выделение и очистку ПЦР фрагментов осуществляли с помощью набора Wizard PCR Preps («Promega», США), согласно рекомендациям производителя.

Оценка бактериального разнообразия методом клонирования фрагмента гена 16S рРНК. Очищенные ПЦР-фрагменты клонировали с помощь pGEM-T easy vector system I (Promega, США) в компетентных клетках E.coli DH10B. Для создания каждой библиотеки клонов случайным образом было отобрано по 50 колоний, проявивших положительную реакцию (белые). С материалом колоний была поставлена ПЦР реакция с универсальными плазмидными праймерами M13F и M13R. Наличие вставки оценивали методом агарозного электрофореза. Генетический материал клонов, содержащих вставки гена 16S рРНК, был секвенирован в сервисной лаборатории с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 на автоматическом секвенаторе ABI 3730 (Applied Biosystems Inc., США).

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез. Разделение смеси ампликонов pmoA проводили с помощью прибора DCode Universal Mutation Detection System («BioRad»,США) при постоянной температуре 60^оС, напряжении 200 V и градиенте денатурантов (формамид, мочевина) 35-60% в течение 6 ч. Полученные гели окрашивали раствором этиди-ум бромида и документировали с помощью имидж-системы Gel Doc System («BioRad», США). Характерные видимые полосы (bands), содержащие ДНК, были вырезаны, полученные после элюирования растворы ДНК были очищены и использованы для определения нуклеотидных последовательностей методом секвенирования.

Гибридизация in situ с флуоресцентномечеными олигонуклеотидными зондами (FISH). Фиксацию образцов раствором параформальдегида и гибридизацию препаратов с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами проводили при температуре 46^оС в соответствии с методикой [11]. Для специфической детекции метанотрофов II типа использовали зонд М-450 (30% формамида в гибридизационном буфере), а метанотрофов I типа – смесь зондов М-84 и М705 (20% формамида) [12].Для детекции представителей домена Bacteria использовали смесь универсальных зондов EUB 338mix [13]. Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем Су3, выполнен компанией «Синтол» (Москва, Россия). Общую численность бактерий определяли в препаратах, окрашенных раствором ДНК-специфичного красителя ДАФИ. Количество гибридизованных с зондами клеток подсчитывали с помощью микроскопа AxioImager D1 («Karl Zeiss», Германия) в 50 полях зрения с использованием светофильтров Zeiss 20 для Cy3-меченных зондов и Zeiss 49 для подсчета клеток, окрашенных ДАФИ, с последующим расчетом на 1 мл обогащенного образца.

Выделение и анализ накопительных культур. Накопительные культуры из обогащенных образцов получали путем регулярных пересевов один-два раза в месяц. Инкубацию вели в статических условиях при температуре 60оС. Процесс роста метанотрофных бактерий при последовательных пересевах контролировали с помощью световой микроскопии, FISH и ПЦР детекции метанотрофов. Представленные результаты анализа были получены для накопительных культур, полученных через 3 месяца инкубации (3-4 пассажа).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов проводили с помощью программного пакета BLAST [].

Результаты и обсуждение. Характеристики гидротерм. В июле 2010 г. был проведен отбор образцов ила и цианобактериальных матов из жерла термальных источников Культурный, Терра, Строма, Квадрат и Глаз дракона, расположенных в районе озера Фумарольное кальдеры вулкана Узон. Физико-химические характеристики вод изученных гидротерм представлены в табл. 1. Все исследованные источники были высокотемпературными со слабокислой или близкой к нейтральной реакцией среды.

Таблица 1. Характеристики термальных источников

Название источника	Координаты		Температура, оС	pН	Eh, мВ
	N	E
Культурный	54030. 115`	1590 59. 279`	63,0	5,2	80
Терра	54029. 887`	1590 59. 410`	65,0	6,2	73
Строма	54029. 854`	1590 59. 477`	56,1	5,3	5
Квадрат	54029. 862`	1590 59. 485`	64,5	6,3	- 22
Глаз Дракона	54029. 885`	1590 59. 468`	59,8	6,2	н.о.

Примечание: н.о. – не определяли.

ПЦР-детекция прокариот. На первом этапе исследования была проведена амплификация фрагментов таксономических и функциональных генов прокариот. Примеры детекции целевых организмов продемонстрированы на рис. 1.

а)

б)

Рис. 1. Визуализация результатов ПЦР с помощью агарозного электрофореза: а – археи, система праймеров 344F-915R; б – метанотро-фы, система праймеров А189F и A682R; 1 – Культурный; 2 – Квадрат; 3 – Терра; 4 –Глаз Дракона; 5 –Строма; «–» отрицательный контроль; «+» положительный контроль, организмы Methanosarcina lacustris (а ), Methylosinus trichosporium (б).

Результаты анализа показали присутствие Bacteria во всех исследованных источниках и Arch-аea в четырех (рис. 2а). Анализ функциональных генов также продемонстрировал различия в составе микробных сообществ. Метанотрофные бактерии были детектированы только в 3 источниках (рис. 1б), а фототрофные – во всех 5 источниках.

Из термальных источников Камчатки с кислой реакцией среды (pH 3,5) были выделены ацидо-термофильные метанокисляющие представители филума Verrucomicrobia [14, 15], в то время как сведения о метанотрофах в высокотемпературных нейтральных источниках Камчатки в литературе отсутствуют. Таким образом, в нашем исследовании впервые было зафиксировано их присутствие в горячих источниках Камчатки.

Распространение фототрофных цианобактерий и анаэробных фотосинтезирующих бактерий в термальных источниках изучено для достаточно большого количества объектов, расположенных в России, Исландии, США и Китае [16], поэтому неудивительным был факт обнаружения организмов, обладающих генами первичной ассимиляции СО 2 во всех исследованных источниках. Для осадков источника Культурный фрагмент гена cbbL был секвенирован, и полученная нуклеотидная последовательность продемонстрировала сходство с депонированной в GenBank последовательностью фототрофной бактерии Chloroflexus . Ни в одном из исследованных источников нам не удалось детектировать присутствие аммонийокисляющих архей, хотя в работе (Zhang et al., 2008) было обнаружено присутствие нитрифицирующих кренархей в высокотемпературных источниках Камчатки [17]. Ни в одном из источников не были обнаружены метаногенные археи. Результаты ПЦР-детекции прокариот в источниках суммированы в табл. 2.

Анализ бактерий в обогащенных образцах методом FISH. Общее количество микроорганизмов, выявленных в обогащенных образцах (окраска ДАФИ), составляло от 5 до 36 х 10⁶ клеток на 1 мл осадка, а количество метаболически активных бактерий (EUB338 mix) варьировало от 2,3 до 21 х 10⁶ клеток на 1 мл осадка (табл. 3). Доля активных бактерий была максимальной (35,6%) в образцах источника Квадрат, а в остальных варьировала от 22,3% до 31,5%.

Таблица 2. Результаты амплификации рибосомальных и функциональных генов бактерий и архей в образцах осадков термальных источников

Образование целевого продукта
Группа прокариот	Целевой ген	Праймерные системы	Термальные источники
			1	2	3	4	5
все Bacteria	16S рРНК	341 F -907 R	+	+	+	+	+
метанотрофные бактерии	pmoA	А189F- A682R	+	-	+	+	-
фототрофные бактерии	cbbL	cbbl1F- cbbLR	+	+	+	+	+
все Archea	16S рРНК	344F-915R	+	+	+	-	+
метаногенные археи	mcrA	mcrAF /mcrAR	-	-	-	-	-
нитрифицирующие кренархеи	amoA	CrenamoA23f -CrenamoA616	-	-	-	-	-

Примечание: источники: 1 – Культурный, 2 – Терра, 3 – Строма, 4 – Квадрат, 5 – Глаз Дракона; «+» -означает детекцию целевого организма, «-» - не обнаружено.

Анализ обогащенных образцов методом FISH выявил высокие значения численности ме-танотрофов I типа (γ- Proteobacteria ) в источниках Культурный, Строма и Квадрат. Количество клеток здесь достигало 1,5-2,0 х 10⁶ клеток на 1 мл осадка. В источниках Терра и Глаз Дракона количество метанотрофов было значительно ниже

– 105 и 104 клеток на 1 г осадка, соответственно. Доля метанотрофов I типа от метаболически активных эубактерий составляла: Культурный – 4,3%; Терра – 3,2%; Строма – 4,2%; Квадрат – 3,4%; Глаз Дракона – 0,2%. Метанотрофы II группы (зонд М-450) ни в одном из исследованных источников обнаружены не были.

Таблица 3. Численность клеток в обогащенных образцах, определенная методом гибридизации in situ с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами и окраской ДАФИ.

Источник	Культурный	Терра	Строма	Квадрат	Глаз Дракона
окраска / гибридизация	количество клеток, х106 /мл осадка
ДАФИ	24±2,2 (68.2%)	11±3,9 (20,1%)	33±5,6 (73,5%)	36±4,5 (61%)	5±0,68 (68,4%)
EUB338 mix	9,7±0,39 (27,6%)	4,2±1,4 (26,8%)	10±1,6 (22,3%)	21±3,3(35,6%)	2,3±0,81 (31,5%)
М-84 + М-705	1,5±0,46 (4,3%)	0,5±0,19 (3,2%)	1,9±0,61 (4,2%)	2±0,49 (3,4%)	0,013±0,002(0,2%)

Оценка разнообразия бактерий в образце ила источника Культурный методом клонирования 16S рРНК. Клонирование ПЦР-фрагментов позволило оценить разнообразие бактерий в источнике Культурный. Из анализа результатов клонирования (табл. 4) следует, что доминирующим организмом (29 клонов) в источнике является метанотроф, наиболее близкий к штамму НВ [16]. Минорные компоненты (1-5 клонов) представлены термофильными организмами, проявившими высокую степень сходства с бактериями, выделенными из термальных источников Камчатки, Йеллоустонского национального парка, Тибета и геотермальных почв Новой Зеландии.

ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента гена pmoA. Для 4 источников, в которых был амплифициро-ван фрагмент гена pmoA, был проведен ПЦР-ДГГЭ анализ, позволяющий оценить разнообразие метанокисляющих бактерий. В табл. 5 представлены данные по анализу нуклеотидных последовательностей характерных полос. Проведенное исследование показало, что во всех источниках присутствуют метанотрофы, наиболее близкие к представителям рода Methylothermus, но отличающиеся от двух описанных видов (79-91% сходства нуклеотидных последовательностей). В образцах из источников Терра и Глаз Дракона были обнаружены последовательности, наиболее близкие к некультивируемым представителям рода Methylomonas (79-90% сходства). Только в образце из источника Терра обнаружены 2 мета-нотрофных организма, в то время как во всех остальных образцах – по одному. В источниках Культурный, Терра, Квадрат идентифицированы метанотрофы, проявившие высокую степень сходства с термофильным метанотрофом НВ [18]. Для метанотрофа из образца Строма ближайшим родственником был Methylothermus sub-terraneus из горячих подземных водоносных слоев золотодобывающих рудников Японии [19].

Характеристика накопительных культур термофильных метанотрофов. Из образцов ила источника Культурный, а также источников Глаз дракона и Строма путем последовательных пересевов на селективных средах были выделены 5 накопительных культур метанотрофов, присутствие которых в обогащенных образцах нам не удалось детектировать. Накопительные культуры представляли собой ассоциации метанокисляю-щих бактерий с гетеротрофными спутниками, однако доля метанокисляющих бактерий в них была высокой. Морфология метанотрофных клеток, дающих сигнал с зондом М-84+М-705 (I группа метанотрофов), была сходной для всех накопительных культур. Это были короткие, крупные (около 1 мкм) округлые палочки, которые хорошо идентифицировались методом фазового контрастирования препаратов живых клеток. Электронно-микроскопический анализ интактных культур метанотрофов культуры К12 выявил присутствие полярного жгутика, а анализ срезов обнаружил мембранные структуры, характерные для метанотрофов I типа. Анализ последовательностей pmoA показал, что во всех накопительных культурах присутствуют метанотрофы, наиболее близкие к Methylotermus.

Таблица 4. Разнообразие бактерий в образце ила источника Культурный методом клонирования 16S рРНК

Номер образца	Ближайший представитель	Процент сходства покрытие/сходство
1 (Культурный, 29 клонов)	Thermophilic methanotroph HB (U89302) Uncultured bacterium clone SL_5.95 (AY550713)	98%(99%) 98%(94%)
2 (Камчатка 14, 15 клонов)	Uncultured Chlorobi bacterium clone VSM5Q1u76 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (EU631213) Uncultured green sulfur bacterium clone SM1H02 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (AF445702)----	95% 94%
3 (Культурный, 5 клонов)	Thermoactinomyces sacchari (AM161154) Uncultured bacterium clone LaC15L24(EF667582) Propionibacterium acnes (AM161153)	98% (83%) 73%(89%) 9%(83%)
4 (Культурный, 1 клон)	Uncultured bacterium clone ZB_P10_C06 (GQ328567) из источника Заварзина в Узоне Uncultured Acidobacteriaceae bacterium (AM935486)	83% (100%) 83% (95%)
5 (Культурный, 1 клон)	Pseudomonas putida (AM161157)	98% (95%)
6 (Культурный, 2 клона)	Uncultured bacterium clone ZB_P14_B04 16S (GQ328675 из источника Заварзина в Узоне Candidate division OP10 clone OPB80 (AF027089) из горячего источника Йеллоустонского парка	73%(97%) 73%(96%)
7 (Культурный, 1 клон)	Uncultured bacterium clone ZB_P13_F12 (GQ328655) из источника Заварзина в Узоне	73%(85%)
8 (Культурный, 1 клон)	Uncultured bacterium clone TP146 (EF205576) hot springs in central Tibet Uncultured Acidobacteria (AM749745) from geothermal soils in New Zealand	78%(97%) 78%(94%)

Таблица 5. Результаты BLAST анализа нуклеотидных последовательностей характерных ДГГЕ полос, полученных при разделении ПЦР фрагментов гена.

Источник	Ближайший родственник	Покрытие/сходство
Культурный	Uncultured bacterium clone SL_5.95 (AY550713) Thermophilic methanotroph HB (U89302)	99/80 99/79
Терра (смесь)	Uncultured bacterium clone SL_5.32 (AY550731) Thermophilic methanotroph HB (U89302)	100/95 100/95
	Uncultured bacterium (AM910134) Uncultured Methylomonas sp . (AB500822)	100/80 100/79
Строма	Methylothermus subterraneus (AB536748)	100/91
Квадрат	Uncultured bacterium clone SL_5.95 (AY550713) Thermophilic methanotroph HB (U89302)	93/88 93/88
Глаз Дракона	Uncultured bacterium (AM910134) Uncultured Methylomonas sp . (AB500822)	95/90 95/87

Выводы: в результате проведенных исследований впервые получены характеристики микробных сообществ гидротерм Камчатки с помощью комплексного молекулярно-биологического подхода, основанного на использовании ПЦР технологий (ПЦР-детекция, ПЦР-ДГГЭ, клонирование) и гибридизации in situ для анализа рибосомальных генов, а также функциональных генов, отвечающих за синтез ключевых ферментов метанотрофии, метаногенеза, автотрофной фиксации СО2, нитрификации). Впервые изучено распространение и разнообразие метанотрофных сообществ в осадках нейтральных высокотемпературных источников. Установлено, что разнообразие термофильных метанотрофов в исследованных источниках ограничивается бактериями, наиболее близкими к Methylotermus и Methylobacter. Получено 5 накопительных высокообогащенных (20-50%) монокультур метанотрофов, в состав которых входят организмы, значительно отличающиеся от двух известных видов рода Methy-lotermus. Культуры являются экстремальными термофилами и их рост осуществляется при значениях температур не ниже 50оС. Дальнейшие исследования предполагают более детальные исследования обнаруженных организмов, выделение чистых культур и описание новых таксонов термофильных метанотрофов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 08-04-00164-а, 09-04-10113-к и 10-04-10127-к.

Рис. 2. Морфология клеток накопительных культур метанотрофов: а – К14, источник Культурный; б – К12, источник Строма (фазовый контраст)