Анализ мутаций в генах KRAS и BRAF при раке толстой и прямой кишки в российской популяции

G12C, G12S, G12R, G12A, G12V, G12D, G13D. Значительно реже выявляются мутации в кодонах 61 (5 %) и 146 (5 %) [13, 19]. Таким образом, тест на наличие мутации гена KRAS необходим пациентам с РТПК для оценки возможности применения таргетной терапии анти-EGFR антителами [13, 19]. Активирующие мутации BRAF встречаются, по разным данным, в 5–15 % случаев РТПК, в 95 % случаев это мутация V600E [2–4, 21]. Существуют противоречивые данные о предсказательной роли мутации BRAF V600E в отношении ответа опухоли на анти-EGFR терапию и прогностической значимости в отношении прогрессирования заболевания [7, 8, 12, 17]. В настоящее время имеются немногочисленные исследования частоты мутаций в гене KRAS и одно исследование мутаций в гене BRAF при РТПК у российских пациентов [2–4, 21].

Соматические мутации возникают в клетках опухоли, которые всегда окружены нормальной тканью. Для гистологического исследования, как правило, берется часть опухолевой и нормальной ткани для приготовления фиксированной в формалине и заключенной в парафин (ФФЗП) ткани в виде блоков. Срезы блоков далее окрашиваются для определения типа опухоли и относительного содержания опухолевых клеток, и несколько срезов используются для выделения ДНК. Для анализа соматических мутаций в ДНК опухоли необходим высокочувствительный метод, позволяющий обнаруживать ДНК с мутацией при содержании минимального количества (5–10 %) опухолевых клеток в образце на фоне ДНК дикого типа из нормальной ткани. В большинстве исследований соматических мутаций используется метод секвенирования по Сэнгеру, который детектирует мутацию только при ее содержании в образце более 20 %, что может привести к ложноотрицательным результатам при меньшем содержании ДНК с мутацией в образце [10, 18]. В некоторых случаях эта проблема может быть решена с помощью макродиссекции опухолевой ткани для обогащения опухолевыми клетками, однако в случае диффузного расположения опухолевых клеток выполнить макродиссекцию не представляется возможным. Для точного анализа мутационного статуса всех опухолей необходим более чувствительный метод. Метод аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (ас-рв ПЦР) обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять мутацию при наличии всего 1–5 % ДНК с мутацией в образце [14].

Целью исследования является анализ частот и спектра мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS и мутации BRAF V600E при РТПК у российских пациентов с помощью высокочувствительных методов анализа.

Материалы и методы

Проводили анализ образцов опухолей от 80 российских больных РТПК из НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и онкологичеcких диспансеров г. Новосибирска. Группа больных состояла из 49 женщин и 31 мужчины в возрасте 24–85 лет (средний возраст – 60,9 года).

Образцы ткани РТПК (n=80), фиксированной в формалине и заключенной в парафин (n=26) и замороженной (n=54), были предоставлены Российским онкологическим научным центром им. Н.Н. Блохина (n=72) и онкологическими диспансерами г. Новосибирска (n=8). Окрашенные срезы ФФЗП ткани были исследованы патоморфологом для определения количества опухолевых клеток. ДНК из замороженной ткани выделяли с помощью набора «QIAampDNATissueMiniKit» (Qiagen, Германия), предварительно подвергнув образцы ручной макродиссекции для обогащения раковыми клетками. ДНК из срезов ФФЗП ткани выделяли с помощью набора «RealLineFFPETex-traction100– («БиоЛинк», РФ) без предварительной макродиссекции.

Анализ мутаций KRAS проводили, тестируя образцы в ас-рв ПЦР, используя набор реагентов «KRAS-7M» («БиоЛинк», РФ), который позволяет обнаруживать наиболее частые мутации 12 и 13 кодонов гена KRAS . Анализ мутации BRAF V600E также проводили с помощью ас-рв ПЦР, используя набор реагентов «BRAFV600E» («БиоЛинк», РФ). Данные тестирования были валидированы с помощью секвенирования.

Набор «KRAS-7M» позволяет проводить анализ мутаций 12 и 13 кодонов гена KRAS методом ас-рв ПЦР для определения наиболее распространённых мутаций: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A и G13D. Диагностика с помощью этого метода возможна, если содержание ДНК с мутацией составляет более 5 %. При этом образец ДНК тестируется в отдельной для каждой мутации реакции, содержащей специфичные праймеры. В каждом эксперименте тестируется положительный стандарт, содержащий 5 % ДНК с мутацией. Полученные кривые амплификации и значения Ct для образца ДНК сравниваются с таковыми для положительного стандарта для определения наличия или отсутствия мутации в исследуемом образце. Анализ мутации BRAF V600E проводили также методом ас-рв ПЦР с помощью набора реагентов «BRAF-V600E». Метод позволяет детектировать наличие мутации при ее содержании в образце более 1 % [15]. Анализ методом ас-рв ПЦР проводили, используя амплификатор «CFX96 Real-Time PCR detection System» (BioRad, США).

Секвенирование ДНК по Сэнгеру проводили для анализа мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS . Продукт ПЦР для секвенирования получали с помощью набора «KRAS-HiSenSeq» («БиоЛинк»,

РФ), который содержит реагенты для амплификации участка гена KRAS , включающего 12 и 13 кодоны. Амплификация происходит в присутствии олигонуклеотида, имеющего последовательность 12 и 13 кодонов KRAS дикого типа и поэтому связывающегося преимущественно с ДНК без мутации, что приводит к ингибированию амплификации ДНК дикого типа и увеличению амплификации ДНК с мутацией [5]. Благодаря обогащению мутантным аллелем в ходе ПЦР становится возможным детектировать мутацию при ее содержании в образце ДНК более 5 % (данные будут опубликованы дополнительно). Продукты амплификации очищали, используя набор реагентов QIA quick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия), и далее проводили секвенирующую реакцию, используя набор реагентов Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Продукты секве-нирующей реакции очищали с помощью набора реагентов Dye Ex2.0 Spin Kit (Qiagen, Германия) и далее анализировали на автоматическом секвенаторе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Данное исследование соответствует гуманистическим и этическим нормам (Хельсинкская декларация, 2000, Директивы Европейского Сообщества 86/609 ЕС), о чем имеется заключение комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ МББ» СО РАМН от 23.10.2012.

Результаты и обсуждение

В данной работе мутации в генах KRAS и BRAF анализировали с помощью высокочувствительного метода ас-рв ПЦР с использованием наборов «KRAS-7M» и «BRAF-V600E». Наборы содержат несколько пар аллель-специфичных праймеров. Такие праймеры на своем 3’-конце содержат последовательность, специфичную к исследуемому аллелю дикого типа или мутантному аллелю, а также TaqMan-зонд для детекции сигнала амплификации в режиме реального времени. При тестировании образцов ДНК со специфичными к мутации праймерами кривая амплификации появляется только при наличии в образце ДНК с мутацией. Если об- разец ДНК не содержит мутации, то эффективность амплификации снижается, что приводит к отсутствию кривой или ее отставанию от кривой ДНК с мутацией на 5 и более циклов. Такой метод анализа мутаций позволяет детектировать мутации в генах KRAS и BRAF с чувствительностью 1–5 %. Подтверждение результатов ПЦР проводили с помощью секвенирования по Сэнгеру. В данной работе для увеличения чувствительности метода был использован набор реагентов «KRAS-HiSenSeq», который позволяет проводить амплификацию участка гена KRAS c обогащением мутантным аллелем, что увеличивает чувствительность метода до 5 %.

Среди исследованных 80 образцов РТПК содержание опухолевых клеток после макродиссекции составляло 5–80 %. В 5 (6 %) случаях опухолевых клеток в образцах было менее 20 %. Возможно, эти образцы не могут быть корректно генотипированы даже после макродиссекции при использовании традиционных методов секвенирования, однако генотипирование таких образцов вполне возможно с использованием в работе методов повышенной чувствительности.

В данной работе все 80 образцов ДНК РТПК были протестированы на мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS с помощью ас-рв ПЦР. Для всех образцов получены данные секвенирования участка гена с 12 и 13 кодонами KRAS для подтверждения результатов ПЦР. В итоге активирующие мутации KRAS обнаружены в 37 (46 %) случаях РТПК (таблица). Из 5 образцов с низким содержанием опухолевых клеток мутация была обнаружена в 2 случаях. При анализе таких образцов традиционным секвенированием по Сэнгеру могли быть получены ложноотрицательные результаты.

Наиболее часто встречающимися мутациями являются G13D (15 %) и G12D (13 %), что согласуется с исследованиями частот мутаций KRAS в других странах [5, 9, 20]. В исследованной выборке не было обнаружено случаев с мутацией KRASG12R. По данным исследований в других странах, частота этой мутации составляет 1–2 % [9, 20]. Образец ДНК из РТПК № 62, полученный из замороженного опухолевого материала, содер- таблица результаты анализа образцов ртПк на мутации в гене KRAS

жал одновременно две мутации: G12V и G13D. Возможно, наличие одновременно двух мутаций связано с гетерогенностью опухоли вследствие поликлональности, где присутствует несколько клеточных популяций с разным генетическим профилем [6]. Образец ДНК № 39 содержал мутацию KRAS G13R, которая была выявлена с помощью секвенирования по Сэнгеру, но не была определена методом ас-рв ПЦР, так как в наборе реактивов «KRAS-7M» не предусмотрена соответствующая аллель-специфическая реакция для детекции этой мутации. Поэтому для обнаружения всех редких вариантов мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS может быть рекомендовано секвенирование ДНК по Сэнгеру с обогащением мутантным аллелем.

В более ранних исследованиях показано, что около 10 % образцов могут иметь расхождения в результатах анализа при тестировании обычным секвенированием по Сэнгеру и более чувствительными методами [10]. В нашем исследовании не было расхождений результатов анализа мутаций в гене KRAS для выборки из 80 образцов благодаря использованию высокочувствительных методов анализа.

Все 80 образцов ДНК из РТПК были протестированы на наличие мутации BRAF V600E методом ас-рв ПЦР. Частота мутации составила 3,8 % (3/80), что согласуется с недавним исследованием в российской популяции, где частота составила 2,7 % (5/195) [21], однако несколько ниже