Анализ накопления и биораспределения золотых наночастиц в мезентериальных лимфатических узлах при пероральном введении

• ¹ Вв едение. Использование наноматериалов в медицине привлекает все более пристальное внимание врачей различных специальностей. Предполагается, что их применение приведет к революционным достижениям в лечении многих заболеваний благодаря способности взаимодействовать с биологическими тканями на молекулярном и клеточном уровнях [1–3].

В последние годы коллоидное золото широко применяется в онкологии, биохимии, иммунологии и лечении ряда аутоиммунных заболеваний [4, 5]. Однако, несмотря на широкое использование золотых наночастиц, многие аспекты их безопасного применения требуют детального анализа. В частности, по отношению к золотым наночастицам недостаточно изучен анализ соотношений между возможной токсичностью, размерами, длительностью и способом введения.

Важное значение в этом аспекте имеют иссле дования тонких морфофункциональных изменений, Ответственный автор — Маслякова Галина Никифоровна Адрес: 410012, г. Саратов, Б. Казачья, 112.

Тел: 8 (8452) 66-97-51

происходящих в органах иммунной системы, в частности в лимфатических узлах [6, 7]. Большую роль в оценке иммунотоксичности экспериментально исследуемого вещества имеет анализ накопления и биораспределения золотых наночастиц (ЗНЧ) в мезентериальных лимфатических узлах, что может косвенно свидетельствовать о последовательности развертывания иммунологического ответа на пероральное введение ЗНЧ.

Цель: провести анализ накопления и биораспределения золотых наночастиц в структурно-функциональных зонах лимфатических узлов с учетом размеров и длительности перорального введения.

Материал и методы. Исследование выполнено на 120 здоровых белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 180–220 г. При разработке модели экспериментального исследования в основу было положено «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [8]. Исследование включало три серии экспериментов, где животным опытных групп перорально вводили золотые наночастицы размерами 1–3 нм, 15 нм и 50 нм в течение 8, 16 и 30 суток.

Распределение золотых наночастиц по зонам лимфатических узлов

Забор материала осуществляли через 24 часа после последнего введения. В эксперименте были использованы ЗНЧ размерами 1–3 нм, 15 нм и 50 нм (концентрация золота во всех образцах 57 мкг/мл), синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (г. Саратов). Для увеличения биодоступности и биосовместимости наночастицы были конъюгированы с полиэтиленгликолем PEG-SH (Nektar, USA).

Серийные срезы лимфатических узлов толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Для оценки биораспределения ЗНЧ в различных зонах мезентериальных лимфатических узлов применялся метод микроскопии темного поля с использованием микроскопа Leica DM 2500 с цветной CCD-камерой и специальной приставкой, позволяющей осуществить боковое освещение при 1000-кратном увеличении. Режим темнопольного освещения реализовали на приборах LEICA DM 2500 и LEICA LMD 7000, используя в качестве источника бокового освещения (БО) осветитель LEICA CLS 150 с двумя световодами, располагая наконечники световодов на расстоянии около 2 см по обе стороны от объектива как можно ближе к плоскости объекта. Для подтверждения выявления ЗНЧ использовалась гистохимическая реакция усиления серебром по Danscher с лактатом серебра, при которой ЗНЧ в случае положительной реакции выглядят при освещении «светлое поле, проходящий свет» как крупноглыбчатые скопления черного цвета (ауросомы), в режиме «темное поле» ауросомы выглядят как ярко светящиеся объекты с красным оттенком на темном фоне. Для количественной оценки распределения ауросом в различных зонах лимфатических узлов применялась специальная компьютерная программа анализа микроскопических изображений Image J.

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет программы «Statis-tica 6.0» (Stat Soft Inc, США). Проверку нормальности распределения значений в выборке проводили с помощью теста Колмогорова — Смирнова. Рассчитывали среднее арифметическое (М); среднюю ошибку среднего арифметического (m); среднеквадратичное отклонение (σ). Показатель достоверности различий (Р) определяли с использованием критериев Стьюдента (t).

Результаты. Проведенные исследования показали, что при 8-, 16- и 30-дневном пероральном введении ЗНЧ размером 1–3 нм ни в одной из зон лимфатических узлов ауросом не регистрируется. Можно предположить, что полученные результаты обусловлены недостаточной чувствительностью метода для определения частиц золота указанных размеров. В группе животных, получавших ЗНЧ размером 15 нм и 50 нм, ауросомы регистрировались во всех зонах лимфатических узлов, а наибольшее их количество отмечалось в зоне мозговых тяжей.

Результаты количественного анализа ауросом при различных размерах и длительности введения ЗНЧ представлены в таблице.

Как следует из таблицы, ЗНЧ размером 1–3 нм ни в одной из зон лимфатических узлов не визуализировались. В то же время независимо от размеров ЗНЧ наибольшее количество ауросом наблюдалось в зоне мозговых тяжей. В зоне лимфатических фолликул при введении частиц размером 15 нм зарегистрировано 486±12 ауросом, в паракортикальной зоне — 21±3 и в зоне мозговых тяжей — 768±21 ауро-сом (различия с предыдущими зонами статистически значимы, Р<0,05). При размерах ЗНЧ 50 нм в зоне мозговых тяжей наблюдалось 481±16 ауросом, лимфатических фолликул — 375±14 ауросом (Р<0,05). Важно отметить тот факт, что количество ауросом во всех зонах лимфатических узлов при сопоставимой длительности введения было значительно больше при размерах ЗНЧ 15 нм, чем 50 нм. При восьмидневном введении ЗНЧ размером 15 нм в зоне лимфатических фолликул зарегистрировано 486±12 ауросом, в паракортикальной зоне — 21±3, в зоне мозговых тяжей — 768±21 ауросом. При размерах ЗНЧ 50 нм указанные показатели составили 357±14, 0 и 481±16 соответственно (Р<0,05). Можно предположить, что меньшее количество ЗНЧ размером 50 нм в лимфатических узлах обусловлено их большими размерами, препятствующими всасыванию в желудочнокишечном тракте. Данное положение находит свое подтверждение в исследованиях Jani P. et al. [9], в результате которых обнаружен размерзависимый эффект всасывания полистиреновых частиц (от 50 нм до 3000 нм). Интересно, что количество ауросом во всех зонах лимфатических узлов при размерах ЗНЧ 15 нм растет практически пропорционально длительности их введения, в то время как при размерах частиц 50 нм данная динамика не прослеживается. При увеличении длительности введения ЗНЧ размером 15 нм с 8 до 30 дней количество ауросом возрастает на 38,1 %, при сопоставимых сроках введения ЗНЧ размером 50 нм — на 4,8%. Полученные различия также, по-видимому, находят свое объяснение в недостаточном всасывании частиц указанных размеров в желудочно-кишечном тракте.

Более детальный анализ полученных результатов позволил выявить среди клеток подкапсульного синуса большое количество фагоцитирующих макрофагов, заполненных ЗНЧ. При исследовании с помощью темнопольной микроскопии с боковым освещением в макрофагах регистрировалось большое количество ауросом, что подтверждает наличие ЗНЧ. С учетом полученных данных можно предположить, что усиленный фагоцитоз ЗНЧ макрофагами является пусковым механизмом иммунного ответа организма на введение ЗНЧ.

Обсуждение. В литературе последних лет сведения о накоплении и биораспределении ЗНЧ в мезентеральных лимфатических узлах отсутствуют [10]. Анализ накопления и распределения ЗНЧ в разных зонах лимфатических узлов может косвенно свидетельствовать о последовательности развертывания иммунологического ответа. В результате исследования установлено, что ЗНЧ размером 15 и 50 нм регистрируются во всех функциональных зонах мезентеральных лимфатических узлов с максимальных накоплением в мозговых синусах при разных сроках введения (8, 16 и 30 дней). В то же время ЗНЧ размером 1–3 нм ни в одной из зон лимфатических узлов не визуализировались, что, возможно, связано с низкой чувствительностью используемого метода исследования.

Заключение. Анализ биораспределения золотых наночастиц в структурных зонах лимфатических узлов экспериментальных животных методом темнопольной микроскопии и автометаллографии показал, что независимо от длительности введения золотые наночастицы размерами 1–3 нм не регистрируются доступными методами ни в одной из зон лимфатических узлов. ЗНЧ размерами 15 и 50 нм выявляли в виде конгломератов в цитоплазме макрофагов и лимфоцитов преимущественно в мантийной зоне лимфоидных фолликулов и мозговых тяжах. Внеклеточные скопления ЗНЧ обнаруживали в мозговых синусах.