Анализ нарушений связывания кортикостероидов с белками плазмы крови в патогенезе острой лучевой болезни

Воздействие на организм ионизирующей радиации в дозах, вызывающих развитие острой лучевой болезни, неизменно сопровождается изменением гормонального уровня организма. Общие закономерности и механизмы воздействия ионизирующих излучений на реакцию гипофизарно-адренокортикальной системы, а также роль связывания кортикостероидов с белками плазмы крови при действии радиации раскрыты в ряде современных адаптационных теорий [1-7]. Проблеме белково-стероидного взаимодействия при различных патологических процессах, в том числе и при остром лучевом синдроме, в организме животных и человека, начиная с середины прошлого столетия, были посвящены многочисленные работы зарубежных и отечественных учёных. Однако в современных научных работах данная проблематика практически не освещается.

В современных зарубежных работах вопросы белково-стероидного взаимодействия раскрыты в ряде клинических исследований, посвящённых изучению вопросов связывания кортикостероидов с белками плазмы крови в гормональном взаимодействии гипоталамо-гипофизарно-

Омельчук Н.Н. - зав. кафедрой, д.б.н., проф. РУДН.

надпочечниковой системы при различных патологических состояниях организма человека [8-15]. В отечественной науке по проблеме белково-стероидного взаимодействия и специфике нарушений связывания кортикостероидов с белками плазмы крови при остром лучевом синдроме имеются лишь отдельные публикации, в том числе и автора настоящего исследования [16-19].

Таким образом, следует признать, что в настоящее время имеет место недостаточный научно-практический интерес к проблеме белково-стероидного взаимодействия в патогенезе острой лучевой болезни. Отметим теоретическую значимость данной проблемы, решение которой позволяет уточнить ряд положений радиобиологии об основных закономерностях связывания кортикостероидов с белками плазмы крови с учётом её различных фракций, что даёт возможность выявить роль свободных кортикоидов в гормональном эффекте при острой лучевой болезни. Возможность проведения более точного прогноза течения лучевой болезни, а также использования полученных результатов в лечебно-диагностической практике в отношении пациентов с лучевой болезнью и пациентов с нарушением эндокринного статуса отражает практическую значимость исследуемой проблемы.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на 20 кроликах-самцах породы шиншилла, весом 3,0-3,5 кг и на 475 белых крысах-самцах линии Wistar, весом 180-200 г. Для исключения неспецифических воздействий на посттрадиционную реакцию коры надпочечников всех животных предварительно в течение 10-15 дней адаптировали к условиям эксперимента, ежедневно проводя ряд процедур, необходимых для проведения данного опыта, во время которого животных помещали в аппарат, не включая его. Сроки, необходимые для адаптации, устанавливали экспериментально на основании оценки уровня кортикостероидов в крови животных: если в течение 3 ч после воздействия неспецифических факторов содержание кортикостероидов в крови находилось в пределах нормальных величин, животных считали адаптированными к условиям эксперимента.

Общее γ-облучение животных проводили на установке ЭГО-2 при средней мощности дозы 575 Р/мин. Животных облучали в дозе, вызывающей острую лучевую болезнь IV стадии: кроликов облучали в дозе 8 Гр, крыс – в дозе 8,5 Гр. Исследуемые показатели у облучённых животных определяли в динамике лучевой болезни. Сроки наблюдения после облучения в экспериментах на кроликах и крысах были различными. Внимание обращалось на характер изучаемых процессов сразу после облучения (через 1-3 ч) и в разгаре острой лучевой болезни (1-30 сут), поскольку, как известно, реакция коры надпочечников на ионизирующее излучение состоит из двух фаз: ранней (в первые часы после облучения) и поздней (через несколько дней после облучения).

Общее содержание 11-ОКС, мкг%, в плазме периферической крови определяли с помощью флюорометрического метода Guillemin et al. [20] в авторской модификации. Применяемый метод основан на способности 11-ОКС флюоресцировать в спирто-кислотном реагенте. Эта реакция кортикостероидов в этанолсернокислотном реагенте специфична для 11-ОКС. В указанных реагентах после протонизации ∆4- 3-кетогруппы в кислой среде происходит взаимодействие ∆4- 3-кетогруппы с II-гидроксильной группой других молекул кортикостероидов. В результате образуются устойчивые межмолекулярные комплексы, которые дают полосу поглощения с максимумом при 470 ммк и специфичную полосу флюоресценции при 525 ммк. Интенсивность флюоресценции измеряли на спектрофлюорометре ХИТАЧИ МР-2 при длине волны возбуждения 470 ммк, флюоресценции – 525 ммк. Интенсивность флюоресценции исследуемых субстратов в каждом опыте сравнивали с интенсивностью флюоресценции растворов соответствующих кортикостероидов различной концентрации.

Для определения свободной и связанной с белком фракций 11-ОКС использовали метод гельфильтрации De Moor et al. [21] в авторской модификации. Гель-фильтрация наименее трудоёмка, позволяет определить специфическое связывание 11-ОКС с кортикостероидсвязывающим глобулином (КСГ), причём в отличие от других методов, даёт возможность измерить абсолютную величину связывания. Количество свободных кортикостероидов определялось по разнице содержания их в цельной плазме и в её белковой фракции после разделения на сефадексе G-25.

Результаты и их обсуждение

Изменения фракционного состава 11-ОКС в плазме крови кроликов после облучения в дозе 8 Гр представлены на рис. 1.

До облучения 30 мин. час после 1,5-2 часа после 4 сутки после    6 сутки после    8 сутки после облучения       облучения       облучения       облучения       облучения

—о— Общий уровень 11-ОКС                      Свободные 11-ОКС

— * —Связанные 11-ОКС                      Свободные 11-ОКС, %

Рис. 1. Изменение фракционного состава 11-ОКС в плазме крови кроликов после облучения в дозе 8 Гр.

При этом были обнаружены значительные изменения белково-стероидного комплекса. У здоровых кроликов все циркулирующие в крови кортикостероиды практически полностью связаны с белками плазмы крови. Через 30 мин и особенно через 1,5-2 ч после облучения свободные 11-ОКС обнаруживались у всех обследованных животных. Свободная фракция гормона на этот срок достигала в среднем 17,4% от общего количества кортикостероидов. Особенно заметное увеличение содержания свободного гормона в крови кроликов наблюдалось через 4 суток после облучения. Около 30,1% от общего количества гормонов находилось в свободном состоянии. Появление не связанной с белком фракции гормона наблюдалось на фоне нормального или даже сниженного общего уровня стероидов в крови, что, вероятно, может вызвать гиперкортикоидное состояние.

Получены результаты изменения общего содержания 11-ОКС в крови в динамике лучевой болезни у животных с двухфазной кривой. Содержание у крыс в крови 11-ОКС суммарно и по фракциям после облучения в дозе 8,5 Гр показано на рис. 2.

До облучения         1 час после         1 сутки после        3 сутки после        10 сутки после облучения           облучения           облучения           облучения

•   Общий уровень 11-ОКС

Свободные 11-ОКС

45%

40%

35%

30%

25%

20%

15%

10%

5%

0%

^■^■^ ^' Связанные 11-ОКС

^^^^™ • Свободные 11-ОКС, %

Рис. 2. Изменение фракционного состава 11-ОКС в плазме крови крыс после облучения в дозе 8,5 Гр.

У здоровых крыс около 9% кортикостероидов находилось в свободном состоянии. Через 1 ч после облучения общий уровень 11-ОКС в крови резко повышался, через сутки возвращался к норме, вновь поднимался на 3-и сутки лучевой болезни и падал на 10-е сутки ниже исходного.

Концентрация свободных 11-ОКС через 1 ч после облучения также повышалась, составляя 23,8% от общего уровня гормона, и нормализовалась через сутки. Затем она вновь увеличивалась, оставаясь повышенной на 3-и и 10-е сутки лучевой болезни. Заслуживает внимания, что у крыс на 3-и сутки лучевой болезни в период вторичной реакции, когда общий уровень 11-ОКС более, чем в 2 раза превышал этот показатель по сравнению с показателем на 10-е сутки, свободные кортикостероиды составляли 17,1% от общего уровня, а на 10-е сутки при общем уровне кортикостероидов даже ниже нормы около 42% кортикостероидов, содержащихся в крови, не были связаны с белками плазмы крови.

Таким образом, как у крыс, так и у кроликов, в динамике острой лучевой болезни наблюдается период скрытого гиперкортицизма, который характеризуется ростом концентрации свободного гормона на фоне даже сниженного общего уровня кортикостероидов в плазме крови. Содержание свободной фракции увеличивается в первые часы и в разгаре лучевой болезни, причём в первые часы это увеличение происходит на фоне повышенного общего содержания кортикостероидов, а в разгаре лучевой болезни на фоне как повышенного, так и сниженного общего уровня.

Заключение

Обобщение полученных результатов в экспериментах на двух видах животных, позволило вывести несколько закономерностей.

• 1.    После действия ионизирующей радиации нарушается связывание кортикостероидов с белками плазмы крови, следствием чего является увеличение свободных, биологически активных гормонов в разгаре лучевой болезни.

• 2.    Независимо от колебаний общего уровня кортикостероидов, содержание их свободной фракции на всём протяжении лучевой болезни было повышенным. Особенно отчётливо это повышение проявлялось в первые часы после облучения и в разгаре лучевой болезни.

• 3.    У крыс адренокортикальная реакция на облучение носит характер двухфазной кривой. В отличие от крыс, у кроликов в пределах времени наблюдения после снижения общего уровня кортикостероидов в крови не отмечалось вторичного гиперкортицизма. Напротив, по мере развития лучевой болезни секреция адренокортикальных гормонов у этих животных продолжала снижаться.

• 4.    Наличие в плазме не связанных с белками и более мобильных вследствие этого стероидов, может вызвать гиперкортикоидное состояние при нормальном или даже сниженном общем уровне гормонов в крови. Длительное влияние «скрытого» гиперкортицизма, таким образом, может явиться фактором, усугубляющим клиническое течение острой лучевой болезни.