Анализ распространения фитоплазм почернения древесины и золотистого пожелтения на виноградниках Краснодарского края

Введение. Фитоплазмы – это патогенные микроорганизмы растений, относящиеся к классу Mollicutes , вызывающие разрушительные заболевания различных сельскохозяйственных культур во всем мире. Они являются облигатными паразитами, ограниченными тканями флоэмы растения-хозяина [1].

Для виноградной лозы заболеваниями, вызываемыми фитоплазмами, являются почернение древесины (Bois noir – BN) и золотистое пожелтение (Flavescence dorée – FD). FD (карантинный объект на территории Российской Федерации) наносит серьезный ущерб виноградникам в Европе.

Симптомы, которые BN и FD вызывают на виноградной лозе, визуально неразличимы и включают скручивание листьев вниз, сопровождающееся изменением их цвета, неравномерное или полное отсутствие одревеснения побегов, увядание гроздей и сморщивание ягод [2]. Несмотря на идентичные симптомы, BN и FD связаны с генетически различными фитоплазмами – Candidatus Phytoplasma solani (подгруппа 16SrXII-A) и Candi-datus Phytoplasma vitis (группа 16SrV) соответственно. Провести видовую идентификацию патогена можно только при помощи молекулярно- генетических методов, что особенно важно для мониторинга Flavescence dorée – карантинного заболевания винограда [3].

Фитоплазма почернения древесины винограда передается виноградной лозе в основном Hyalesthes obsoletus Signoret, многоядной цикадкой, завершающей свой биологический цикл преимущественно на травянистых растениях [4, 5]. BN молекулярно-генетическими методами в Краснодарском крае было впервые обнаружено в 2018 г. [6].

Фитоплазма золотистого пожелтения винограда переносится североамериканской цикадкой Scaphoideus titanus Ball [7]. В настоящее время в России не было установлено случаев заболевания винограда золотистым пожелтением, однако в Краснодарском крае, Донецкой области и в Крыму была обнаружена цикадка S. titanus [8– 10]. В связи с этим важно мониторить распространение данного заболевания в России.

Цель исследования – изучить распространение фитоплазменной инфекции на виноградниках Краснодарского края методом ПЦР.

Объекты и методы. Объектом исследования являются виноградные растения различных сортов, имеющие внешние симптомы фито- плазменной инфекции (рис.), отобранные на промышленных виноградниках в 9 различных географических точках Краснодарского края Темрюкского, Анапского и Новороссийского районов (зоны основного размещения вино- градников в крае). Отбор материала производился в период с третьей декады июня по вторую декаду сентября 2023 г., было отобрано 239 растительных образцов для ПЦР-анализа.

Растение винограда, пораженное фитоплазмой (сорт Алиготе, Темрюкский р-н)

Материалом для экстракции тотальной ДНК послужили симптомированные листья (их жилки и черешки), собранные в насаждениях сортов Шираз, Шардоне, Каберне Совиньон, Саперави, Мицар, Молдова, Августин, Пино блан, Рислинг, Алиготе. Экстракцию ДНК производили с использованием буфера на основе катионного детергента ЦТАБ (цетилтриметиламмония бромид), по протоколу, рекомендованному ЕРРО (European plant protection organization) для выделения фитоплазм из растительного материала винограда [11]. Анализ препаратов тотальной ДНК на наличие фитоплазменной инфекции осуществляли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе QuantStudio 5 (Сингапур) при помощи коммерческого набора для идентификации возбудителей фитоплазм почернения древесины и золотистого пожелтения (ООО «Синтол», Россия, Москва), а также ряд образцов проанализированы с использованием тест-системы, рекомендованной ЕРРО [11]. Реакционные смеси, общим объемом 25 мкл, включали стандартные компоненты для ПЦР-РВ, реализуемой по технологии TaqMan, в концентрациях, объемах и пропорциях, рекомендованных разработчиками используемых идентификационных систем.

Условия ПЦР-РВ устанавливали исходя из протоколов, описанных разработчиками идентификационных систем. Достоверность положительных результатов оценивали исходя из следующих критериев: наличие и значение порогового цикла (Ст) – не выше 40, морфология кривых амплификации, суммарное значение сигнала и его изменение за цикл, наличие и идентичность кривых амплификаций внутреннего контроля реакции, отсутствие специфической амплификации в отрицательных контрольных образцах. А также для сопоставления результатов часть образцов была проанализирована праймерами, рекомендованными EPPO.

Результаты и их обсуждение. На данный момент на наличие фитоплазменной инфекции проанализировано 239 образцов с помощью набора производства «Синтол», в т. ч. 12 образцов маркерами, рекомендованными для использования EPPO. В 113 образцах (47 % исследованного материала) обнаружена ДНК Candidatus Phytoplasma solani. Фитоплазма золотистого пожелтения Candidatus Phytoplasma vitis не обнаружена ни в одном из проанализированных образцов.

Во всех точках сбора материала молекулярно-генетическим методом подтверждено наличие виноградных растений, пораженных фитоплазмой почернения древесины Bois noir. Концентрация патогена различна: Ст – от 22 до 38. Отмечается корреляция между интенсивностью морфологических симптомов фитоплазменной инфекции и пороговым циклом ПЦР, которые в свою очередь имеют связь со сроками отбора материала. Так, наибольший процент (100 %) положительных результатов, наравне с наиболее ранними Ст, среди проанализированных образцов отмечен по сортам Шардоне, Алиготе, Рислинг и Пино блан в Новороссийском и Темрюкском районах – отбор материала проводился в августе–сентябре. А наименьший процент выявленных положительных реакций выявлен по сортам Мицар (Анапский р-н), Саперави и Молдова (Темрюкский р-н), материал с которых отбирался в конце июня (табл.).

Результаты диагностики фитоплазменных заболеваний на виноградниках Краснодарского края

При анализе результатов, полученных при использовании коммерческого набора и тест-системы ЕРРО, данные оказались сопоставимы: положительные результаты наличия патогена в соответствующих образцах, а также пороговые циклы обнаружения патогена находятся на одних и тех же значениях.

Заключение. Проведен мониторинг фито-плазменных инфекций – почернения древесины Bois noir и золотистого пожелтения Flavescence dorée на виноградниках Краснодарского края с помощью ДНК-маркерных тест-систем. Возбудитель фитоплазмы почернения древесины Candidatus Phytoplasma solani выявлен во всех точках сбора материала в Темрюкском, Ново- российском и Анапском районах Краснодарского края; фитоплазма золотистого пожелтения Candidatus Phytoplasma vitis нами не обнаружена. Исследования по анализу распространения данных фитоплазм продолжаются.