Анализ статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (p14ARF, CDKN2B и RM) при раке молочной железы

Актуальность. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Развитие новых методов ранней диагностики РМЖ является необычайно актуальной и важной задачей. В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гипермети- лирования ДНК. В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках.

Цель исследования. Изучение характера метилирования промоторных и регуляторных областей генов контроля клеточного цикла при спорадическом РМЖ. Для характеристики профиля метилирования при спорадическом РМЖ были выбраны гены p14^ARF, CDKN2B и Rb1 .

Материал и методы. В качестве объекта исследовались 39 опухолей РМЖ. ДНК была выделена из опухолевых образцов с использованием набора GenElute^TM Mammalian Genomic DNA («Sigma», США). Метилспецифическую ПЦР проводили с использованием праймеров на промоторные регионы генов (Xing et al., 1999; Roncalli et al., 2002; Gonzalez-Gomez et al., 2003). Бисульфитную модификацию ДНК проводили в течение 1 ч при 95 ºС. Модифицированную ДНК очищали с помощью набора «Wizard® DNA Clean-up System» («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Фрагменты ДНК фракционировали с помощью гель-электрофореза в 2,5 % агарозном геле и визуализировали в проходящем свете на установке «GelDoc» («Bio-Rad», США).

Результаты. Анализ статуса метилирования гена р14ARF дал следующие результаты: 19 образцов из 33 имели как метилированный, так и неме-тилированный аллель, что составило около 58 % от общего количества исследуемых образцов; в четырех случаях наблюдали только метилированный аллель, что составило 12 % от общего количества. В целом аберрантное метилирование гена обнаружено в 70 % случаев. Ядерный белок р14 обладает способностью стабилизировать и активировать белок р53 – «хранитель генома», за счет инактивации белка MDM2, который вызывает деградацию р53. В то же время увеличение количества активного р53 подавляет экспрессию р14ARF и активизирует транскрипцию MDM2. Таким образом, в клетке существует авторегуля-торная «петля», которая действует по механизму обратной связи и связывает экспрессию ряда генов (р53, р14ARF и MDM2). Гиперметилирование промоторной области гена р14ARF обнаружено при раке пищивода (15 %) (Xing E. et al., 1999), легкого (8 %) (Zochbauer-Muller S. et al., 2001) и толстой кишки (28 %) (Esteller M. et al., 2001). Ген р14ARFлокализован в регионе 9p21, в одном районе с генами р16/INK4a/CDKN2А и p15/ INK4b/CDKN2В в пределах 50 тыс. п. о. Статус метилирования гена CDKN2B в опухолях РМЖ составил около 8 % (3 из 39 исследуемых образцов, причём все имели как метилированный, так и неметилированный аллель). Ген CDKN2B расположен вблизи CDKN2A, обладает с ним высокой гомологией, а его продукт, как и CDKN2A, ингибирует циклинзависимую протеинкиназу cdk4. В отличие от CDKN2A ген CDKN2B экспрессируется не постоянно, а только в ответ на действие трансформирующего фактора роста β (TGF-β). Гиперметилирование CDKN2B – доминирующий способ инактивации этого гена-супрессора в опухолях системы кроветворения. Частота метилирования CDKN2B при В-клеточных острых лимфолейкозах составляет 64 %, при Т-клеточных острых лимфолейкозах – 44 % и при лимфомах – 62 % (Baur A.S. et al., 1999). В солидных опухолях метилирование CDKN2B встречается редко. Статус метилирования гена Rb1 был проанализирован в 36 опухолях РМЖ. Аберрантного метилирования гена Rb1 в нашем исследовании не было обнаружено. Отмечен вклад аномального метилирования этого гена в происхождение других опухолей. В частности, метилирование гена Rb1 отмечено в 25 % образцов глиобластомы, а с помощью иммуногистохимических методов установлено снижение его экспрессии (Nakamura M. et al., 2001). Негативное влияние метилирования на экспрессию Rb1 показано и при раке легкого (Geradts J. et al., 1999).

Выводы. При анализе статуса метилирования трех генов контроля клеточного цикла в опухолях РМЖ наибольшая частота аберрантного метилирования промоторного региона была выявлена для гена р14^ARF (70 %), аномальное метилирование гена CDKN2B встречается редко (8%) и не обнаружено гиперметилирования гена Rb1. Метилирование промотора р14^ARF снижает экспрессию гена и, таким образом, способно нарушить механизм регуляции р53-пути в клетке и, соответственно, приводить к развитию опухоли.

Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАМН «Молекулярно-генетические механизмы формирования и прогрессии РМЖ»