Анализ структурных и морфометрических преобразований главных эпителиоцитов слизистой оболочки желудка крыс на фоне хронической ингаляционной интоксикации толуолом

В современных условиях промышленного производства и техногенной нагрузки на окружающую среду проблема воздействия химических токсикантов на организм человека и животных приобретает все большую актуальность. Среди многочисленных опасных соединений особое место занимают ароматические углеводороды, которые широко используются в различных отраслях промышленности – от производства полимеров и лаков до фармацевтики и нефтепереработки. Толуол (метилбензол) является одним из наиболее распространенных представителей этого класса веществ. Его высокая летучесть и способность накапливаться в жировых тканях обусловливают значительный риск как острой, так и хронической интоксикации при ингаляционном и перкутанном путях поступления в организм [1, 2]. Известно, что толуол обладает политропным токсическим действием, поражая центральную нервную систему, кроветворные органы, печень и почки [3]. Однако в последние годы все большее внимание исследователей привлекает его гастротоксический эффект, который может лежать в основе развития профессионально обусловленных заболеваний желудочно-кишечного тракта у работников соответствующих производств [1, 4].

органелл (ядра, митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети, аппарата Гольджи).

• •    Провести количественную морфометрическую оценку ультраструктурных параметров главных клеток: площади ядра, соотношения гетеро- и эухрома-тина, площади и состояния митохондрий, площади секреторных гранул.

• •    Проанализировать динамику выявленных изменений в различные сроки постреакционного периода, оценив степень обратимости деструктивных процессов.

• •    На основании полученных данных предложить возможные механизмы гастротоксического действия толуола на уровне главных клеток и их роль в формировании гастропатий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование выполнено на 48 половозрелых беспородных крысах-самцах, полученных из вивария Луганского государственного медицинского университета. Исходная масса животных составляла 150–180 г. Все крысы содержались в стандартных условиях вивария при температуре 22±2 °C, относительной влажности 55±10% и 12-часовом световом цикле, со свободным доступом к воде и стандартному лабораторному корму. Животные были разделены на две основные группы: экспериментальную (n=24) и контрольную (n=24). Экспериментальная модель хронической ингаляционной интоксикации толуолом была воспроизведена с использованием специальных герметичных стеклянных затравочных камер объёмом 100 л. В течение 60 дней крысы экспериментальной группы подвергались ежедневному (5 дней в неделю) 4-часовому воздействию паров толуола (химически чистый, CAS № 108-88-3, производства ООО «Компонент эпоксидных смол», Россия) в концентрации, эквивалентной 10 предельно допустимым концентрациям (ПДК) для рабочей зоны. Контрольные животные содержались в идентичных условиях вивария, но без воздействия токсиканта.

Дизайн исследования предусматривал оценку изменений в различные сроки после завершения курса интоксикации для изучения динамики процессов повреждения и восстановления. Материал забирали на 1, 7, 30 и 60-е сутки постреакционного периода. На каждом сроке из опытной и контрольной групп выводили по 6 животных. Эвтаназию проводили под глубоким эфирным наркозом путем передозировки анестетика с последующей декапитацией.

Сразу после эвтаназии осуществляли лапаротомию и извлекали желудок. Орган тщательно промывали холодным (4°C) изотоническим раствором хлорида натрия (0,9%) для удаления содержимого. Для макроскопического и органометрического ис- следования измеряли длину большой и малой кривизны, толщину стенки в кардиальном, фундальном и пилорическом отделах с помощью штангенциркуля с точностью до 0,1 мм. Затем желудок вскрывали по большой кривизне, расправляли на восковом блоке и фиксировали.

Программное обеспечение, используемое для морфометрической оценки, обеспечивало расчет ряда количественных параметров, характеризующих состояние главных клеток (ГК). К анализируемым показателям относились: площадь, занимаемая гетерохроматином (Sгх) и эухроматином (Sэх) в ядре; производное соотношение Sгх/Sэх; толщина слоя маргинального (пристеночного) гетерохроматина (Lгх); суммарная площадь цитоплазматического сечения, занятая профилями митохондрий (Sм); общая площадь, которую в цитоплазме занимали секреторные гранулы (Sсг); площадь профиля комплекса Гольджи (Sкг). Сравнительный анализ данных параметров проводился для главных клеток СОЖ крыс в различные интервалы реадаптационного периода после 60-дневной ингаляции толуолом и сопоставлялся с аналогичными показателями клеток контрольной группы.

Количественный морфометрический анализ для каждого гистологического препарата выполнялся на основе оценки шести стандартных полей зрения с фиксированной площадью с использованием специализированного аппаратно-программного комплекса. Для детального морфологического изучения было выбрано увеличение ×16 000, что обеспечивало оптимальный баланс между охватом значительной площади исследуемой клетки и возможностью четкой визуализации формы и размеров её секреторных гранул.

Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили с использованием программ Microsoft Excel 2016 и STATISTICA 10.0 («StatSoft Inc.», США). Поскольку все исследуемые выборки соответствовали нормальному распределению, данные представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки среднего (m). Для оценки достоверности различий между контрольной и экспериментальными группами применяли параметрический t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Различия считались статистически значимыми при уровне p<0,05.

Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом ФГБОУ ВО Луганский государственный медицинский университет им. Свт. Луки (протокол №1 от 25 марта 2019 г.). Содержание животных и проведение эксперимента соответствовали директиве Европейского союза 2010/63/EU и «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ Минздравсоцразвития России № 708н от 23.08.2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Расчётный подслизисто-слизистый индекс на 1-е и 7-е сутки эксперимента демонстрировал рост почти в два раза, достигая значений 0,273±0,01 и 0,231±0,04 соответственно. В структуре слизистой оболочки визуализировались железы с признаками трансформации морфологии как главных, так и париетальных клеточных элементов.

Светооптическое гистологическое исследование выявило наличие выраженных деструктивных изменений в СОЖ животных после 60-суточной ингаляционной экспозиции парами толуола. Характерным морфологическим признаком токсического воздействия оказалась интенсивная вакуолизация цитоплазмы в большинстве главных клеток. Также часто отмечалось образование мелких кистоподобных полостей внутри слизистой оболочки (феномен микрокистообразования).

К 30-м и 60-м суткам экспериментального периода практически все цитоморфометрические параметры, за исключением показателя численности главных гландулоцитов, демонстрировали тенденцию к сглаживанию и приближению к значениям, характерным для контрольной группы животных.

Интегральный анализ экспериментальных данных позволяет заключить, что к структурным особенностям желудочной стенки, формирующимся под токсическим влиянием толуола и способствующим развитию гастропатий, относятся: гипертрофия подслизистой основы, уменьшение толщины СОЖ, снижение клеточной плотности с изменением пропорционального соотношения специализированных клеток в железах, а также усиление инфильтративных процессов в межэпителиальных пространствах и собственной пластинке слизистой оболочки. Существенным гастротоксическим свойством толуола остается его способность индуцировать процессы гибели эпителиоцитов, приводящие к атрофическим изменениям СОЖ. Сравнительный анализ структурных преобразований в эпителиальных клетках после ингаляционного воздействия парами толуола указывает на наличие прямой зависимости динамики деструктивных процессов от временного фактора экспериментального воздействия.

Следует отметить, что при толуоловой интоксикации мы выявили гетерогенность главных эпителиоцитов по степени выраженности дезорганизации и нарушения структурной целостности.

Значительным изменениям подвергались количественные характеристики ГК. Количество главных клеток (ГК) было снижено на 36% (p<0,01) и на 26% (p<0,02) на 1-е сутки и 7-е сутки соответственно.

При ультраструктурном анализе в основной массе главных клеток регистрировались значительные патологические изменения ядерного аппарата, проявляющиеся интенсивной конденсацией хроматинового материала. Параллельно отмечалось выраженное дилатирование цистернальных пространств гранулярной эндоплазматической сети, сопровождающееся процессом дегрануляции и формированием вакуолей, а также появлением везикул с характерным окаймлением. Со стороны митохондриального компартмента наблюдались формы с повышенной электронной плотностью (гиперосмиро-ванные митохондрии), что отражено на рисунке 1.

Рисунок 1. Фрагмент главного гландулоцита СОЖ крысы на 1 сутки наблюдения. Деструктивные изменения ядер с резкой конденсацией хроматина гиперосмированные формы митохондрий. Видны ядрышки с явлениями сегрегации. В парануклеар-ной зоне наблюдаются участки локального некроза, отёк органелл и расширение межклеточного пространства. Ув. ×32 000 Figure 1. Fragment of a gastric chief cell of the rat gastric mucosa on day 1 of observation. Destructive nuclear changes with marked chromatin condensation; hyperosmiophilic mitochondria. Nucleoli with segregation are visible. Foci of local necrosis, organelle oedema and widening of the intercellular space are seen in the paranuclear zone. Magn. ×32 000

Гранулярная эндоплазматическая сеть оказалась наиболее уязвимой органеллой, подвергающейся глубокой трансформации как в париетальных, так и в главных гландулоцитах. У значительной части клеток фиксировались грубые нарушения её структуры в виде массивной дегрануляции, достигающей в ряде случаев полной потери рибосомальных частиц с мембранных поверхностей и накопления в гиалоплазме свободных монорибосом и полисомальных комплексов.

Дополнительно усугублялись нарушения, затрагивавшие ядерные структуры и прилежащие цитоплазматические области. Характерными признаками были расширение перинуклеарной щели, изменение конфигурации ядерной оболочки с появлением причудливых очертаний, а также нарушение пространственного распределения эу- и гетерохроматиновых компонентов. В цитоплазме пара-нуклеарной зоны визуализировались очаги фокального некробиоза и цитофагосомальные включения. Аналогичные некротические изменения обнаружи- вались и в пределах расширенного перинуклеарного пространства.

Комплекс выявленных субклеточных повреждений включал также дезорганизацию крист митохондрий, прогрессирующую дегрануляцию элементов ГЭР, отёчную трансформацию указанных органелл и увеличение просвета межклеточных промежутков. К числу доминирующих ультраструктурных сдвигов в главных клетках следует отнести дилатацию профилей гранулярной эндоплазматической сети (рис. 1) и околоядерного межмембранного компартмента.

Нарушения затрагивали и организацию рибосомального аппарата: происходила утрата упорядоченного расположения рибосом на мембранах эндоплазматической сети, разрушались связи между индивидуальными рибосомами и мембранной поверхностью. Совокупность этих изменений является морфологическим свидетельством глубокого расстройства одного из фундаментальных процессов клеточного метаболизма – биосинтетической функции.

При использовании метода электронной микроскопии было отмечено, что цитоплазма ГК была переполнена опустошенными секреторными гранулами, комплекс Гольджи занимал ее незначительную часть и состоял из плотно упакованных цистерн (рис. 2).

В ряде случаев в цитоплазме ГК наблюдается увеличение числа миелиновых фигур, лизосом. Нередко обнаруживали крупные вакуоли, мультивези-кулярные тельца и миелиноподобные структуры, в отдельных клетках определяли небольшие локусы цитоплазматического лизиса, что свидетельствовало об интенсификации деструктивных процессов в клетках (рис. 3).

В совокупности изложенные результаты свидетельствуют о существовании причинной связи между факторами, дестабилизирующими клеточные и лизосомальные мембраны и активностью гидролитических ферментов лизосом в развитии деструктивных поражений СОЖ.

Согласно полученным данным, в ядрах главных гландулоцитов на 1-е и 7-е сутки уменьшалась площадь, занимаемая эухроматином на 39% (р<0,01) и на 40,88% (р<0,01); увеличивалась площадь, занимаемая гетерохроматином на 42,02% (р<0,05) и на 69% (р<0,01) (рис. 4); соотношение Sгх/Sэх увеличилось в 2,3 и в 2,8 раза при р<0,01 соответственно, что может свидетельствовать о снижении синтетических процессов с участием ядра.

Морфометрический анализ выявил достоверное увеличение толщины маргинального хроматинового слоя до 0,81±0,03 мкм (p<0,01) по сравнению с контрольным значением 0,60±0,02 мкм на первые сутки эксперимента. К седьмым суткам данный показатель достиг величины 0,89±0,05 мкм, в то время как в контроле он составлял 0,64±0,05 мкм (p<0,02), что отражено на рис. 4.

Сравнительный анализ ультраструктурных преобразований ядерного аппарата эпителиоцитов СОЖ в более поздние сроки наблюдения (30-е и 60-е сутки) показал существенное снижение выраженности патологических изменений по сравнению с острым периодом (1-е и 7-е сутки). Ядра главных гландулоцитов характеризовались значительным преобладанием эухроматина, при этом объём гетерохроматина был незначительным и приближался к физиологическим показателям контрольной группы.

Рисунок 2. Фрагмент ультраструктуры главного эпителиоцита: заполненность секреторными гранулами (СГ), расширены профили гранулярной эндоплазматической сети (ГрЭС), комплекс Гольджи (КГ) представлен плотно упакованными цистернами. Ув. 18 000

Figure 2. Ultrastructure of a chief cell: cytoplasm filled with secretory granules (SG); dilated profiles of the rough endoplasmic reticulum (rER); the Golgi complex (GC) is represented by tightly packed cister-nae. Magn. ×18 000

Рисунок 3. Ультраструктура главного гландулоцита на 1 сутки эксперимента: усиление аутофагических процессов, расширен профиль гранулярной эндоплазматической сети (ГрЭС), активизация комплекса лизосом (Л), множество секреторных гранул (СГ). Ув. 28 000

Figure 3. Ultrastructure of a chief cell on day 1 of the experiment: enhanced autophagy, dilated profile of the rough endoplasmic reticulum (rER), activation of the lysosomal compartment (L), numerous secretory granules (SG). Magn. ×28 000

■ Эухроматин ■ Гетерохроматин

Рисунок 4. Показатели Sэх и Sгх в процентном соотношении в ядрах ГК СОЖ крыс экспериментальной и контрольной групп на 1 и 7 сутки наблюдения после 60-дневной ингаляции толуолом Figure 4. Euchromatin (Seu) and heterochromatin (Shc) areas in the nuclei of chief cells of the rat gastric mucosa in the experimental and control groups on days 1 and 7 of observation after 60-day toluene inhalation

Рисунок 5. Фрагмент ультраструктуры главного экзокриноцита СОЖ экспериментальной группы на 60 сутки наблюдения. Множество секреторных гранул (СГ), комплекс Гольджи (КГ) с преобладанием вакуолярных и цистернальных элементов. Ув. 16 700 Figure 5. Ultrastructure of a chief exocrine cell of the gastric mucosa, experimental group, day 60 of observation. Numerous secretory granules (SG); the Golgi complex (GC) is dominated by vacuolar and cisternal elements. Magn. ×16 700

В цитоплазме большинства главных эпителиоцитов отмечалась активация лизосомального аппарата, структурной особенностью которого являлась однослойная фосфолипидная мембранная оболочка.

О возобновлении синтетической активности клеток свидетельствовала морфология ядер: они имели увеличенные размеры и светлый эухроматино-вый фон, а гетерохроматин формировал лишь тонкий маргинальный ободок. Цитоплазматический матрикс содержал многочисленные митохондрии округлой конфигурации с чётко визуализируемыми параллельными кристами и плотным электронным матриксом. Перинуклеарное пространство было заполнено рибосомальными частицами; определялось крупное ядрышко с доминированием гранулярного компонента над фибриллярным. Также визуализировались расширенные каналы гранулярной эндоплазматической сети. Аппарат Гольджи демонстрировал адаптивную перестройку, чётко отражающую изменения функционального состояния клетки: в его структуре начинали преобладать вакуо-лярные и цистернальные элементы (рис. 5).

Независимо от срока эксперимента в цитологии главных клеток происходит снижение площади цитоплазмы, занимаемой секреторными гранулами (Sсг), как низкой (SСГН), так и средней (Sсгс) электронной плотности (рис. 6). Sсгн на 1 сутки эксперимента составила 148,78±7,73 мкм2 (р<0,01), в группе контрольных животных показатель был 241,19±8,46 мкм2, следовательно, отличие составило 38%. Аналогичная картина наблюдалась и на 7 сутки эксперимента: Sсгн была снижена на 39,25% и составила 132,87±6,67 мкм2 (р<0,01). Sсгс на 1 сутки равнялась 205,18±7,01 мкм2 (р<0,01) и 175,72±8,59 мкм2 (р<0,01) на 7 сутки, что соответствовало снижению этого показателя на 34,13% и 41,07%.

Достаточно часто при ультраструктурном анализе идентифицируются главные клетки, демонстрирующие характерные признаки апоптотической гибели. К числу наблюдаемых морфологических маркеров апоптоза относилось изменение архитектоники ядра, выражавшееся в конденсации и последующей фрагментации ядерного хроматина. На начальных этапах происходило формирование компактных зон конденсированного хроматина в перинуклеарной области, часто принимавших серповидную или подковообразную конфигурацию. По мере прогрессирования процесса фрагменты плотного хроматина появлялись в центральных отделах ядра (рис. 7). Количество подобных очагов конденсации могло варьировать. Завершающей стадией являлось образование так называемых апоптотических телец – изолированных фрагментов ядерного материала вместе с участками цитоплазмы, содержащими интактные органеллы и окруженными элементами плазмолеммы.

S_CrH — гранулы низкой электронной плотности

контроль

М 1-е сутки ^м 7-е сутки

205,18

S_crc — гранулы средней электронной плотности

* — р < 0,05 относительно контроля.

Контрольное значение Scrc и данные по 5КГ в тексте статьи не приведены и на диаграмму не вынесены.

Рисунок 6. Показатели Sсгс, Sсгн и Sкг ГК в разные сроки наблюдения после 60-дневной ингаляции толуолом

Примечание: * – показатели достоверности относительно контрольной группы (р<0,05)

Figure 6. Areas of medium-density (Ssgm) and low-density (Ssgl) secretory granules and of the Golgi complex (Sgc) in chief cells at different observation intervals after 60-day toluene inhalation.

Note: * — statistically significant difference from the control group (p < 0.05)

Figure 7. Ultrastructure of a chief exocrine cell of the rat gastric mucosa on day 1 of the readaptation period after 60-day toluene inhalation. Chromatin condensation (Hc) in the central zone of the nucleus (N) is demonstrated. Magn. ×32 000

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные демонстрируют, что хроническая интоксикация толуолом вызывает двухфазный ответ со стороны главных клеток СОЖ: фазу острой деструкции (1-7 сутки) и фазу реституции (30–60 сутки). Выявленное уменьшение количества ГК и дезорганизация их ультраструктуры коррели- руют с макроскопическими и органометрическими признаками гастропатии (атрофия СОЖ, отек подслизистой основы).

Ключевым звеном в повреждении главных клеток, по-видимому, является митохондриальная дисфункция. Обнаруженная деструкция крист неизбежно ведет к нарушению окислительного фосфорилирования и дефициту АТФ, что согласуется с данными о роли митохондриальной недостаточности в патогенезе многих заболеваний, в том числе и повреждений слизистых оболочек [8-10]. Снижение энергообеспечения может напрямую влиять на активность синтетических процессов, что подтверждается выявленными изменениями аппарата ГЭР и уменьшением площади секреторных гранул.

Значительная перестройка ядерного хроматина (рост доли гетерохроматина) является морфологическим коррелятом подавления транскрипционной активности [11]. Это, наряду с индукцией апоптоза, указывает на прямой генотоксический эффект толуола или его метаболитов. Способность ароматических углеводородов вызывать окислительное повреждение ДНК и запускать апоптоз описана в ряде исследований [12, 13].

Важным результатом является демонстрация обратимости большинства выявленных изменений к 60-м суткам. Это свидетельствует о высоких регенераторных потенциях главных клеток и о том, что устранение токсического воздействия позволяет запустить процессы внутриклеточной регенерации. Однако исходная гибель части клеточной популяции, вероятно, вносит вклад в длительное функциональное состояние органа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ультраструктурными маркерами острого повреждения главных клеток являются деструкция митохондриальных крист, конденсация ядерного хроматина с увеличением доли гетерохроматина и дегрануляция гранулярной эндоплазматической сети.

Морфометрические сдвиги (снижение площади секреторных гранул, изменение соотношения хроматина) объективно отражают угнетение секреторной и синтетической функций клеток.

Выявленная динамика с почти полным восстановлением ультраструктуры к 60-м суткам свидетельствует о значительных компенсаторных резервах главных клеток и обратимости индуцированных толуолом изменений при прекращении воздействия токсиканта.