Анализ связи полиморфизма -31G/С (RS9904341) в гене BIRC5 с риском возникновения рака мочевого пузыря

Доля рака мочевого пузыря (РМП) составляет 3–5 % всех злокачественных новообразований и около 40 % от опухолевых заболеваний мочеполовой системы [1, 2]. До 80 % случаев РМП составляет немышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (НМИ РМП), для которого характерна склонность к рецидивированию. Поиск диагностических и предикторных параметров, позволяющих предсказать течение заболевания, является актуальной проблемой. Принимая во внимание сложность и неоднозначность процессов онкогенеза, можно предположить, что наиболее успешным будет интегративный подход, сочетающий клиникоморфологические и молекулярно-генетические параметры [3]. В ряде исследований были обнаружены факторы генетической предрасположенности к риску развития РМП и прогрессированию этого заболевания. В частности, была подтверждена взаимосвязь полиморфизма -31G/С, расположенного в промоторной области гена белка сурвивина, приводящего к изменению уровня мРНК этого белка, c риском развития рецидивирующего рака. Сурвивин – это одноцепочечный низкомолекулярный белок (м.м. 16,5 кДа), относящийся к группе белков-ингибиторов апоптоза (IAP), все члены которого имеют как минимум один бакуловирус-ный IAP повтор (BIR), состоящий примерно из 70 аминокислот. Данный повтор обеспечивает их взаимодействие с проапоптотическими белка- ми. Сурвивин – мультифункциональный белок, способный ингибировать апоптоз, регулировать деление клеток и способствовать ангиогенезу [4]. Практически во всех типах рака наблюдается сверхэкспрессия сурвивина [5, 6], что может объясняться нуклеотидными вариациями в регуляторной области гена этого белка. В частности, было показано, что полиморфизм -31G>C (rs9904341), расположенный в промоторной области гена сурви-вина, коррелирует с экспрессией этого гена: аллель 31С проявляет существенно более высокую активность по сравнению с 31G [7]. По данным метаанализа 2019 г., выполненного Мoazeni-Roodi et al., наличие 31С аллеля коррелирует с риском возникновения большинства типов рака либо в целом, либо среди азиатского населения [8]. Для случая рака мочевого пузыря в азиатской популяции установлена ассоциация полиморфизма rs9904341 для рецессивной модели наследования (СС vs GG+GC, ОШ 1,8, 95 % ДИ 1,36–2,54 p<0,001). В то же время этот генотип у европейской популяции был связан с защитой против рака полости рта, рака легких, уротелиального рака и опухоли Вильмса, а для таких типов рака, как гепатоцеллюлярная карцинома, карцинома пищевода, рак кожи и рак шейки матки, ассоциаций вообще не было выявлено. В работах [9–11] показана ассоциация полиморфизма rs9904341 с риском уротелиального рака. Исследования, демонстрирующие связь данного полиморфизма с риском возникновения РМП, немногочисленны, проведены только для азиатского населения [12–14]. Во всех публикациях отмечается необходимость дополнительных исследований данной ассоциации.

Целью нашего исследования было изучить связь между полиморфизмом -31G/С (rs9904341) в промоторной области гена белка сурвивина BIRC5 и риском возникновения заболевания РМП у пациентов Красноярского края.

Материал и методы

Образцы крови пациентов с диагнозом РМП отобраны специалистами КГБУЗ «Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского». Исследование одобрено на заседании локального этического комитета, протокол № 27 от 02.07.2020. От всех пациентов, принявших участие в исследовании, получено информированное согласие. После клинического обследования и опроса у врача-онколога заболевание было охарактеризовано по клинико-морфологическим признакам, к которым относились: стадия, степень дифференцировки, прогрессирование заболевания и инвазия опухоли в стенку мочевого пузыря. Образцы венозной крови здоровых доноров получены от Красноярского краевого центра крови № 1.

Всего исследовали 158 образцов ДНК пациентов, среди них: 30 женщин и 128 мужчин (средний возраст 65,6 ± 10,7 года, медиана: 66,5; С25 – С75: 59 – 72). В контрольной группе были образцы ДНК 117 здоровых доноров, среди которых 27 женщин и 90 мужчин, средний возраст 60,2 ±5,1 года (медиана: 60; С25 – С75: 57 – 63,3). В группе пациентов и контрольной группе русские соcтавляли 95,4 и 96,6 % соответственно.

ДНК выделяли набором «ExtractDNA Blood» (Евроген, Россия). Синтез участка, содержащего полиморфизм rs9904341, проводили с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Hot Start Taq (Евроген, Россия) и праймеров, фланкирующих целевой участок: Up праймер – 5’- GAAGGCCGCGGGGGGTGGACC – 3’; Dn праймер – 5’- GCGGTGGTCCTTGAGAAA-GGGCTGCC – 3’.

Олигонуклеотиды, использованные в работе, синтезированы ООО Биосан (Россия).

Высокоочищенные препараты белков репортеров – мутантных вариантов Са²⁺-регулируемого фотопротеина обелина (OL) с разными характеристиками биолюминесценции, а также их конъюгатов: OL(W92F,H22E)-политимидилат (dT)₃₀ и OL(Y138F)-антитело к 6-карбоксифлуоресцеину (FAM), получали, как описано ранее [15].

Реакцию удлинения специфичных праймеров (РЕХТ) проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1-кратный буфер SNPdetect (Евроген, Россия), по 2,5 μM каждого dNTP, 2,5 μM Bio-dUTP (Биосан, Россия), по 1 pmol праймеров PEXT G – FAM-CCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCG и PEXT C – (A)₂₇-CCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCC, 2 ед. акт. полимеразы SNPdetect (Евроген, Россия). Условия реакции: 95 °С в течение 5 мин; 3 цикла (95 °С – 15 сек, 60 °С –15 сек, 72 °С – 15 сек); 95 °С в течение 5 мин.

Биолюминесцентный анализ продуктов реакции PEXT проводили, как описано ранее [15]. Кратко: в лунки планшета (Costar, США), активированные стрептавидином [16], вносили 47 мкл гибридизационного буфера и 3 мкл раствора продуктов PEXT-реакции или буфера (контрольные образцы), инкубировали 30 мин и промывали. Далее в лунки вносили по 50 мкл смеси конъюгатов OL(W92F,H22E)-(dT)₃₀ и OL(Y138F)-антитела к FAM, инкубировали, промывали и измеряли биолюминесценцию сформированных на поверхности комплексов с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после впрыскивания 70 мкл 0,1 М CaCl₂ в 0,1 М Tris-HCl pH 8,8. Интегральные сигналы записывали по очереди: фиолетовый через оптический фильтр ФС6 (ЛенЗОС, Россия) в течение 1 с и далее зеленый через оптический фильтр ЖС17 (ЛенЗОС, Россия) – в течение 3 с. Все измерения проводили в 2 повторностях, учитывали сигналы от контрольных лунок. Генотип определяли по отношению величины зеленого сигнала к фиолетовому (дискриминационный фактор, D).

Последовательности трех образцов с генотипами GG, GC, CC дополнительно подтверждены секвенированием по Сэнгеру (ЦКП «Геномика» СО РАН, Россия). При генотипировании образец GC использовали как внутренний контроль.

Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения Statistica 12 (Statsoft, Россия) и Microsoft Excel для Windows 10. Для сравнения количественных данных использовали U-тест Манна–Уитни. Для качественных характеристик использовали тест χ2. Для сравнения частот вариантов гена среди контрольных образцов и случаев РМП применяли критерий χ2-Пирсона. Исследуемая выборка находилась в равновесии Харди–Вайнберга для контролей и для случаев (p>0,05). Ассоциацию между вариантами rs9904341 и РМП оценивали по отношению шансов (OШ) с 95 % доверительным интервалом (ДИ), с уровнем значимости p<0,05.

Для вычисления отношения шансов использовали калькулятор расчета статистики в исследованиях «случай–контроль» на сайте «Ген Эксперт» http://84.201.145.131/.

Среднее значение величин указано с квадратичным отклонением.

Результаты

Для выявления аллельного состава ДНК использовали способ, разработанный и успешно протестированный нами ранее. Он реализуется в 3 этапа: а) синтез фрагмента, содержащего полиморфный сайт, с помощью реакции ПЦР; б) реакция удлинения аллель-специфичных праймеров, несущих разные метки (олиготимидилат либо анти- FAM антитело), в ходе которой в состав продукта включаются звенья биотинилированного уридина; в) твердофазный биолюминесцентный анализ полученных биотинилированных продуктов, схема которого приведена на рис. 1. Наличие аллелей определяют по биолюминесцентному сигналу соответствующих репортеров: зеленый сигнал регистрируется при наличии аллеля G, фиолетовый – аллеля С. Отношение этих сигналов – дискриминационный фактор D – отражает аллельный состав образца ДНК. Данный способ был нами ранее успешно использован при исследовании полиморфизмов, связанных с предрасположенностью к возникновению меланомы кожи [17], нарушениями гемостаза [18], склонностью к развитию нейросенсорной тугоухости [19]. Надежность этого способа генотипирования обеспечивает существенная (около порядка) разница между значениями дискриминационного фактора D для каждого генотипа. Так, в нашем исследовании D принимал следующие значения: 6,52±2,13 (n=105) генотип GG; 0,99±0,21 (n=136) генотип GС; 0,06±0,04 (n=34) генотип CC.

Полиморфизм rs9904341(G/C) определен для всех 275 образцов ДНК (табл. 1). Исследуемые генотипы и аллели находились в равновесии Харди–Вайнберга (p>0,05). Между экспериментальной и контрольной группами не было выявлено статистически значимых различий при анализе распределения генотипов (табл. 1).

Анализ результатов генотипирования аллельных вариантов полиморфизма rs9904341(G/C) показал, что в исследуемой группе (пациенты плюс контроль) частота встречаемости аллелей G и С составила 0,629 и 0,371 соответственно. По данным о частоте исследуемых аллелей, представленным в базе NCBI результатов проекта 1000 Genomes , они сопоставимы с таковыми для европейской популяции: 0,693 и 0,306 для аллелей G и С соответственно.

Связь между наличием аллеля С и риском возникновения рака мочевого пузыря оценивали по рецессивной модели наследования, объединив всех носителей – гетерозигот и гомозигот (табл. 2).

аллель С allele С

Г\_ Green signal

Violet signal

Рис. 1. Схема твердофазного биолюминесцентного анализа продуктов PEXT-реакции Fig. 1. Scheme of the bioluminescent solid-phase analysis of the PEXT reaction products

Таблица 1/Table 1

Распределение частот генотипов полиморфного варианта среди пациентов и в контрольной группе distribution of genotype frequencies for polymorphic variant among patients and in the control group

Генотип/ Genotype	Сравниваемые группы/Study groups		ОШ (95% ДИ)/ OR (95% CI)	р
	Больные/Pаtients (n=58)	Контроль/Control (n=117)
GG	62 (39,2 %)	43 (36,8 %)	1,11 (0,68–1,82 %)
GC	82 (51,9 %)	54 (46,2 %)	1,26 (0,78–2,03 %)	0,12
CC	14 (8,9 %)	20 (17,1 %)	0,47 (0,23–0,98 %)

Таблица 2/Table 2

Распределение генотипов по рецессивной модели наследования genotypes distribution according to the recessive inheritance model

Генотип/ Genotype	Сравниваемые группы/Study groups		ОШ (95% ДИ)/ OR (95% CI)	р
	Больные/Pаtients (n=58)	Контроль/Control (n=117)
GG + GC	144 (91,1 %)	97 (82,9 %)	2,12 (1,02–4,4 %)	0,04
CC	14 (8,9 %)	20 (17,1 %)	0,47 (0,23–0,98 %)

Таблица 3/Table 3

Распределение генотипов среди пациентов с разным типом инвазии РМП genotypes distribution among patients with different types of bladder cancer invasion

Генотип Genotype	Мышечно-инвазивный тип (T2-T4)/ Muscle-invasive type (T2-T4) (n=55)	Немышечно-инвазивный тип (Та, Tis, T1)/ Non-muscle invasive type (Та, Tis, T1) (n=103)	ОШ (95% ДИ %) OR (95% CI %)	р
GG	27 (49,1 %)	35 (34 %)	1,87 (0,96–3,65 %)
GC	26 (47,3 %)	56 (54,4 %)	0,75 (0,39–1,45 %)	0,08
CC	2 (3,6 %)	12 (11,7 %)	0,29 (0,06–1,33 %)

Можно видеть, что носителей генотипа CС достоверно меньше в группе пациентов: (8,9 % vs 17,1 %, p=0,04), т.е. риск развития рака мочевого пузыря у них почти в 2 раза меньше по сравнению с GG генотипом.

В табл. 3 приведены результаты исследования по распределению генотипов среди пациентов, имеющих мышечно-инвазивный (T2-T4) и немышечноинвазивный тип опухоли (Tа, Tis, T1).

Можно видеть, что носители генотипа СС в группе пациентов с мышечно-инвазивным типом опухоли встречались реже, чем в группе с немышечно-инвазивным типом опухоли: 3,6 % vs 11,7 %, однако данное различие не было статистически значимым (p>0,05).

В исследуемой группе у 21 пациента наблюдалось прогрессирование заболевания (как для мышечно-инвазивного, так и для немышечноинвазивного типа), однако связи прогрессирования с генотипом не обнаружено.

Обсуждение

Обнаруженная нами связь свидетельствует о наличии защитного эффекта для носителей СС генотипа в отношении риска возникновения РМП. Этот факт отличается от опубликованных ранее данных о повышенном риске РМП [12–14], в которых носительство аллеля С связано с повышенным риском возникновения рака. В то же время Srivastava et al. в своем метаанализе показали, что такая связь характерна только для азиатских популяций. То есть расхождения с опубликованными данными могут быть связаны с этническими различиями между изучаемыми группами населения [20]. При сравнении частот встречаемости этого аллеля среди европейского и азиатского населений и исследованной нами группы людей (275 человек) ее можно отнести к европейской популяции (табл. 1). К сожалению, данные о связи аллельного состава с риском РМП среди европейцев весьма немногочисленны. Единственное исследование на эту тему, проведенное в Европе (Сербия), обнаружило эффект повышенного риска уротелиального рака для носителей GG генотипа [11]. Защитный эффект носительства СС генотипа среди европейцев был показан для некоторых других видов рака [21].

Нельзя исключить, что наблюдаемый нами эффект связан с тем, что контрольная группа в целом моложе экспериментальной (p<0,05) (см. Материал и методы). Однако, поскольку точные сроки возникновения заболевания установить невозможно, более старший возраст в группе пациентов может быть связан с поздним обращением к врачу.

В литературе изложено несколько версий о механизме эффекта данного полиморфизма при изучении других видов опухолей. Так, Antonacopoulou et al. в своем исследовании колоректального рака показали, что аллель -31С связан с повышенной экспрессией изоформ сурвивина. При этом у пациентов с генотипом GG худшая выживаемость по сравнению с носителями аллеля С [22]. Функции изоформ сурвивина еще не до конца изучены. Однако в ряде публикаций сообщается о проапопто-тическом эффекте изоформ сурвивина 2β и 2α [23, 24]. Это связано с тем, что транслируемая область этих изоформ не содержит полную последовательность домена BIR, который отвечает за антиапопто-тическую форму сурвивина: у сурвивина 2β домен BIR укорочен, а у сурвивина 2α он отсутствует. При этом изоформы сурвивина способны образовывать «молчащие» гетеродимеры с сурвивином дикого типа, блокируя его антиапоптическую функцию, характерную для гомодимера дикого типа [25]. Andric et al. показали, что снижение экспрессии проапоптотических изоформ сурвивина у носителей генотипа GG может способствовать развитию опухоли [26].

Исследования на клеточных линиях CHO, HeLa показали намного более высокую транскрипционную активность аллеля С по сравнению с аллелем G, что приводит к повышенной экспрессии сурвивина [27]. Однако это не свидетельствует об однозначно плохом прогнозе и повышении шанса