Анализ связи полиморфного локуса RS1052133 гена OGG1 с риском развития злокачественных новообразований у людей, подвергшихся радиационному воздействию

Рак является мультифакторным заболеванием, характеризующимся сложным взаимодействием как генетических, так и внешнесредовых этиологических факторов. На сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что существенный вклад в инициацию рака вносят генетические факторы [1], среди которых определённую роль играют однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП).

Сегодня особое внимание исследователей уделяется полиморфизму rs1052133 гена оксогуанин-гликозилазы 1 – OGG1 (8-Oxoguanine DNA Glycosylase-1) [2, 3]. OGG1 кодирует фермент ДНК-8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу 1, которая участвует в эксцизионной репарации оснований, защите ДНК от повреждения и индукции онкотрансформации [4]. Согласно литературным данным минорный аллель G полиморфизма rs1052133 вызывает снижение активности репарации ДНК и связан с риском развития злокачественных новообразований (ЗНО) различных локализаций [5, 6]. В эпидемиологических исследованиях носительство гомозиготного генотипа G/G полиморфизма rs1052133 связывают с повышенным риском возникновения различных типов ЗНО, включая рак пищевода [7], желчного пузыря [8], рака лёгкого [9], а также с повышенным риском развития карциномы лёгкого [10].

Генетическая предрасположенность может являться одним из факторов повышенного риска возникновения ЗНО, возникающих при внешнесредовых воздействиях, в частности, ионизирующего излучения (ИИ). В последнее десятилетие особую актуальность имеет изучение влияния малых доз ИИ на риск развития ЗНО [11], главным образом, в контексте широкого внедрения радиационных методов в медицинскую практику [12]. По данным некоторых авторов до 2% ЗНО могут быть результатом медицинского облучения [13]. Важным вкладом в оценку средне-популяционных рисков возникновения ЗНО при хроническом воздействии ИИ являются исследования последствий радиоактивного загрязнения территорий р. Течи и Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРСа). Согласно Крестининой и др. (2020) [14] избыточный относительный радиационный риск заболеваемости ЗНО у населения этих территорий составляет 0,08 на 100 мГр (95% доверительный интервал (ДИ) 0,039-0,113).

В настоящее время проблема индивидуального риска возникновения радиационных эффектов у лиц, имеющих генетическую предрасположенность, является открытой. Согласно Публикации 103 МКРЗ (2007) [15] в научной среде находит признание факт, что вариантные гены низкой пенетрантности могут создавать «высокопеременную экспрессию рака после радиационного воздействия». В частности, предполагается, что полиморфизмы в генах, принимающих непосредственное участие в процессах репарации повреждений ДНК, в сочетании с радиационным воздействием, могут модифицировать ответ организма и влиять на канцерогенный риск [16]. Однако, спустя почти 15 лет с момента выхода в свет Публикации 103 МКРЗ (2007), объём данных в пользу такой точки зрения по-прежнему ограничен. В связи с этим, ОНП в данных генах могут рассматриваться как потенциальные предикторы развития радиационно-индуцированного канцерогенеза.

Целью настоящего исследования стало установление ассоциативной связи между полиморфизмом rs1052133 гена эксцизионной репарации оснований OGG1 и риском развития ЗНО у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Материалы и методы

Характеристика группы облучённых лиц. Исследование риска развития ЗНО проводилось среди лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на р. Тече и ВУРСе. Облучённые лица, вошедшие в настоящее исследование, много лет наблюдаются в ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России» (УНПЦ РМ). В рамках этих наблюдений у пациентов проводился забор цельной крови. При этом все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на проведение исследования, согласованное с этическим комитетом УНПЦ РМ. Для исследуемых лиц были рассчитаны индивидуальные поглощённые дозы облучения красного костного мозга (ККМ) и мягких тканей с использованием дозиметрической системы Techa River Dosimetry System (TRDS 2016) [17]. Следует отметить, что из-за присутствия остеотропных изотопов ^89,90Sr среди радионуклидов, попавших в окружающую среду, поглощённые дозы на ККМ на порядок превышали дозы на мягкие ткани и у отдельных лиц достигали нескольких Гр. При этом дозы на мягкие ткани были меньше 750 мГр у всех обследованных (табл. 1). Исследуемые в данной работе лица были разделены на две группы: облучённые лица с онкологическими заболеваниями («облучённые с ЗНО» – 300 человек), у которых на период проведения анализа в анамнезе содержались сведения о ЗНО различной локализации, и облучённые лица без онкологических заболеваний («облучённые без ЗНО» – 588 человек). Подробная характеристика исследуемых лиц представлена в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика исследуемых лиц

Показатель	Облучённые без ЗНО	Облучённые с ЗНО
Объём выборки, N	N=588	N=300
мужчины Пол, N (%)                жен щины	198 (33,7%) 390 (66,3%)	127 (42,3%) 173 (57,7%)
славяне Этническая группа, N (%)	286 (48,6%) 302 (51,4%)	145 (48,3%) 155 (51,7%)
Возраст, лет1 (min-max)	75,46±8,22 (57-98)	75,84±7,53 (55-95)
Доза облучения ККМ, мГр M±SD (min-max)2	592,83±26,14 (0,70-3393,51)	523,10±33,89 (0,74-3507,07)
Доза облучения мягких тканей, мГр M±SE (min-max)2	83,61±4,51 (0,02-644,64)	87,69±6,83 (0,02-740,78)

Примечание: 1 – среднее значение ± стандартное отклонение (min-max); 2 – среднее значение ± стандартная ошибка (min-max).

Представленные группы были сопоставимыми по полу, этническому составу, возрасту, а также по дозам облучения ККМ и мягких тканей. Структура заболеваемости ЗНО среди исследуемых лиц представлена на рис. 1.

30%

Органы пищеварительной системы а Органы женской репродуктивной системы “ Органы покровной системы я Органы дыхательной системы - Органы мочевыделительной системы и Органы мужской репродуктивной системы

Органны эндокринной системы

Рис. 1. Структура ЗНО у лиц когорты реки Течи.

Всего в анализ были включены 300 человек с подтверждёнными случаями ЗНО различных локализаций. Среди диагностированных форм солидных ЗНО были следующие: ЗНО органов пищеварительной системы – 89 человек (код по МКБ-10 С00.2, C02.1, C04.9, С06.9, C15.9, C16.9, С18.4, С19, C22.9, C25.9), органов женской репродуктивной системы – 80 человек (код по МКБ-10 С50, С53.9, С54.9, С57.4), органов покровной системы – 43 человека (код по МКБ-10 С44.90), органов дыхательной системы – 36 человек (код по МКБ-10 C32.9, С33, С34), органов мочевыделительной системы – 22 человека (код по МКБ-10 C67.9, C68.9), органов мужской репродуктивной системы – 19 человек (код по МКБ-10 С61), органов эндокринной системы – 11 человек (код по МКБ-10 С73). Основным источником информации о состоянии здоровья пациентов являлась база данных УНПЦ РМ и программный комплекс REGISTR, разработанный в УНПЦ РМ [18]. Выявленные случаи ЗНО диагностированы в период с 1969 по 2020 гг. Верификация диагнозов осуществлялась на основе гистологического, цитологического и лабораторно-инструментального подтверждения.

Генотипирование. Для генотипирования использовались замороженные при -80 °С образцы ДНК, хранящиеся в банке тканей УНПЦ РМ. Генотипирование проводилось методом ПЦР «в реальном времени» на приборе StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием набора для генотипирования полиморфного маркера («Тест-Ген», Россия). Нуклеотидная последовательность праймера (F): 5′-CAGTGGATTCTCATTGCCTTC-3′, (R): 5′-AACCCTTTCTGCGCTTTG-3′. Условия амплификации соответствовали протоколу фирмы-производителя: первая денатурация – 95 °С/2 мин; 94 °С/10 сек, 60 °С/1 мин – 40 циклов.

Статистический анализ. Оценка отклонения распределения частот генотипов исследованного полиморфизма от ожидаемого равновесного распределения по закону Харди-Вайнберга (HWE) проводилась с использованием критерия χ2 в онлайн-калькуляторе Gene Calc . Анализ различий в частотах генотипов между группами проводили с использованием онлайн-калькулятора Medstatistic calculators/. Оценка ассоциации аллелей и генотипов в полиморфном локусе rs1052133 с риском развития ЗНО проводилась с использованием расчёта показателя отношения шансов (ОШ) и 95% ДИ. Ассоциация считалась статистически значимой при р<0,05.

Анализ межфакторных взаимодействий в отношении риска развития ЗНО проводился методом многофакторного снижения размерности [19]. Расчёты проводились в программном пакете MDR v. 3.0.2 . Значимость взаимодействий оценивалась точностью предсказания (Testing Balanced Accuracy, TBA) не менее 55% и согласованностью перекрёстной проверки (Cross Validation Consistency, CVC) не менее 9 из 10. Значение p было установлено с помощью теста 1000-кратной перестановки. Ассоциация считалась статистически значимой при р<0,05. Вклад каждого фактора и/или их взаимодействия оценивается величиной энтропии Н, выраженной в процентах.

Результаты и обсуждение

Оценка связи полиморфизма rs1052133 с риском развития ЗНО. В ранее проведённых нами исследованиях, включающих 170 облучённых человек с онкологическими заболеваниями, была выявлена связь полиморфизма rs1052133 гена OGG1 с риском развития ЗНО. В соответствии с кодоминантной моделью было установлено, что у носителей генотипа С/G полиморфизма rs1052133 ОШ составило 2,14, 95% ДИ [1,43-3,22] [16].

В настоящем исследовании мы расширили группу облучённых лиц с ЗНО до 300 человек и провели анализ связи полиморфизма rs1052133 с риском развития ЗНО. Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs1052133 гена OGG1 представлено в табл. 2.

Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs1052133 гена OGG1 соответствовали ожидаемому равновесному распределению по закону Харди-Вайнберга в группе «Облучённые без ЗНО» p=0,97. В то же время, в группе «Облучённые с ЗНО» наблюдалось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга (p=0,04). Для установления причины нарушения равновесия Харди-Вайнберга было рассчитано значение индекса Fis (Fixation index size), которое составило -0,146, что указывает на избыток гетерозигот в данной группе.

Далее была проведена оценка связи полиморфизма rs1052133 гена OGG1 с риском развития онкологических заболеваний на основе рецессивной и доминантной моделей наследования, рассматриваемых в настоящем исследовании (табл. 3).

Таблица 2

Частотное (%) распределение аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs1052133 гена OGG1

Группа	Частота генотипов, N (%)			Частота аллелей, N (%)		p-value (HWE1)
	OGG1 rs1052133
	G/G	C/G	C/C	G	C
Облучённые с ЗНО (N=300)	13 (4,33%)	135 (45%)	152 (50,67%)	161 (26,83%)	439 (73,17%)	0,04
Облучённые без ЗНО (N=588)	31 (5,27%)	212 (36,05%)	345 (58,68%)	274 (23,30%)	902 (76,70%)	0,97
χ2	χ2=6,70, p=0,04			χ2=2,68, p=0,10

Примечание: 1 – HWE – Hardy-Weinberg Equilibrium (равновесие Харди-Вайнберга).

Таблица 3

Анализ связи полиморфизма rs1052133 гена OGG1 с риском развития ЗНО

Модель	Генотип	Облучённые без ЗНО	Облучённые с ЗНО	ОШ (95% ДИ)	p-value
Рецессивная	C/C-C/G	557 (94,7%)	287 (95,7%)	1,00	0,54
(GG/GC+CC)	G/G	31 (5,3%)	13 (4,3%)	0,81 (0,42-1,58)
Доминантная	C/C	345 (58,7%)	152 (50,7%)	1,00	0,02
(CC/GG+GC)	C/G-G/G	243 (41,3%)	148 (49,3%)	1,38 (1,05-1,83)

В результате исследования выявлено, что риск развития ЗНО у носителей минорного аллеля rs1052133*G был статистически значимо выше по сравнению с носителями генотипа C/C. Значение ОШ составили 1,38; 95% ДИ [1,05-1,83], p=0,02.

В большинстве исследований влияния полиморфных участков генов на риск развития рака рассматриваются отдельные локализации. С целью установления связи выявленного полиморфного участка с отдельными видами ЗНО был проведён анализ в группе облучённых лиц с ЗНО, которые наиболее широко представлены в исследуемой выборке и составили в общей сложности более 50% от общего числа регистрируемых новообразований. Для этого была составлена группа облучённых лиц с ЗНО органов пищеварительной системы (89 человек) и женской репродуктивной системы (80 человек).

В результате проведённого анализа не было обнаружено статистически значимой связи между носительством минорного аллеля rs1052133*G и риском развития новообразований органов пищеварительной системы и женской репродуктивной системы.

Согласно результатам проведённого MDR анализа наибольший вклад в формирование предрасположенности к развитию заболевания вносит доза облучения ККМ (0,66%) и полиморфизм rs1052133 (0,54%), тогда как доза на мягкие ткани не оказывает значимого влияния (<0,01%). При рассмотрении межфакторных связей был отмечен синергизм между полиморфизмом и дозой на ККМ (TBA=0,56; CVC=10/10; p=0,01). Дендрограмма межфакторных взаимодействий представлена на рис. 2.

Рис. 2. Дендрограмма межфакторных взаимодействий.

Продукт гена OGG1 – 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы 1 играет важную роль на первом этапе защиты клетки от накопления повреждений ДНК. Фермент вырезает побочный продукт окисления гуанина – 8-дигидро-7,8-оксогуанозина (8-oxodG), который возникает в результате повреждения ДНК активными формами кислорода. В случае, если не происходит удаление 8-oxodG, то он может стать причиной ошибок кодирования и приводить к трансверсии C→A, которая достаточно часто встречается в злокачественных опухолях [20]. Результаты различных исследований поиска ассоциации ОНП генов, защищающих клетку от повреждающего действия ИИ, с канцерогенным риском свидетельствуют о потенциальной возможности применения некоторых ОНП в качестве биологических маркеров предрасположенности к отдалённым эффектам воздействия ИИ, прежде всего, ЗНО [21]. Однако наличие рискового полиморфного аллеля не всегда определяет риск развития патологии, в связи с этим оценивается не только ассоциативная связь, но и регуляторный потенциал конкретного ОНП. Несмотря на отсутствие данного полиморфного участка в базе данных полногеномных исследований GWAS на основе анализа открытых ресурсов VannoPortal и RegulomeDB был установлен регуляторный потенциал полиморфного участка rs1052133. Согласно рангу RegulomeDB полиморфный участок rs1052133 обладает высоким регуляторным потенциалом (значение 0,554 по шкале от 0 до 1) и представляет собой вариант экс-прессионного локуса в мотиве связывания транскрипционного фактора или в регионе гиперчувствительности к ДНКазе (eQTL-вариант). Подобные замены приводят к изменению в сайтах связывания транскрипционных факторов, меняя их афинность, что в свою очередь может отражаться на эффективности транскрипции [22]. Данный вариант представляет собой миссенс мутацию С/G и приводит к замене Pro332Ala. Кроме того, при оценке геномной патогенности согласно модели прогнозирования regBase полиморфизм rs1052133 имеет вероятность вовлечённости в патологический процесс (значение по шкале 0,77; likely pathogenic), а оценка онкогенно-сти указывает на наличие драйверного эффекта (0,96; likely cancer driver).

На сегодняшний день многочисленные исследования подтвердили связь между rs1052133 и риском развития многих видов рака у необлучённых людей. Результаты генетических исследований показали статистически значимую связь аллеля rs1052133*G с повышенным риском таких видов рака как: рак мочевого пузыря ОШ=2,05; 95% ДИ [1,36-3,08] [23], рак желчного пузыря ОШ=4,5; 95% ДИ [1,1-22,4] [24] и рак лёгких ОШ=2,1; 95% ДИ [1,2-3,7] [25]. Наблюдаемый сенсибилизирующий эффект аллеля G в отношении риска развития рака может быть обусловлен тем, что OGG1, несущий аллель дикого типа rs1052133*С, обладает в 7 раз более высокой активнос- тью в отношении удаления 8-oxodG из ДНК, чем OGG1, несущий мутантный аллель rs1052133*G [26]. Однако результаты исследований по установлению связи rs1052133 с отдельными видами рака до сих пор остаются противоречивыми. Данные тезисы справедливы, например, для гинекологического рака, где повышенный риск у носителей аллеля rs1052133*G был обнаружен в работах [27-29], но не подтверждён в других работах [30-32].

В настоящем исследовании установлено, что аллель rs1052133*G гена OGG1 является рисковым в отношении развития ЗНО у облучённых людей. У облучённых лиц (888 человек) обнаружена статистически значимая связь аллеля rs1052133*G гена OGG1 с развитием злокачественных опухолей различных локализаций ОШ=1,38; 95% ДИ [1,05-1,83], p=0,02, согласно доминантной модели наследования. Однако при оценке риска развития отдельных ЗНО (пищеварительной и женской репродуктивной систем) не выявлено статистически значимой связи, что вероятно связано с низкой статистической мощностью из-за небольшого количества обследованных лиц, имеющих данные виды рака.

Был отмечен синергетический эффект взаимодействия накопленной дозы облучения ККМ и аллеля rs1052133*G гена OGG1 в отношении риска развития ЗНО.

Отсутствие значимого влияния дозы облучения мягких тканей на модификацию генетически-ассоциированного риска появления злокачественных опухолей, вероятно, связано с тем, что средняя доза облучения мягких тканей находится в диапазоне до 100 мГр, и выборка в 500-700 человек слишком мала, чтобы обнаружить статистически значимый эффект. Это хорошо согласуется с оценкой избыточного относительного риска заболеваемости (8% на 100 мГр).

Заключение

В результате исследования было установлено, что полиморфизм rs1052133 гена OGG1 может быть рассмотрен в качестве потенциального биологического маркера риска развития злокачественных опухолей различной локализации, при хроническом радиационном воздействии в диапазоне доз от 0,74 до 3507,07 мГр (среднее 523,10±33,89 мГр). Отмечено, что наличие рискового генотипа rs1052133*G в сочетании с радиационным воздействием может модифицировать риск развития ЗНО, на что указывает синергическая взаимосвязь данного ОНП и дозы облучения ККМ.