Анализ связи уровня метилирования генов MIR10B и MIR21 в лейкоцитах крови с клинически выраженным атеросклерозом сонных артерий



Атеросклеротическое поражение сосудов является одной из основных проблем современного здравоохранения, поскольку может приводить к таким серьезным осложнениям, как ишемическая болезнь сердца и ишемический инсульт, которые в течение последних 15 лет остаются ведущей причиной заболеваемости и смертности в мире. Чаще всего атеросклероз поражает определенные участки сосудистого русла — коронарные и сонные артерии. Во все процессы и стадии атеросклеротического поражения — от ранней дисфункции эндотелия до механизмов, приводящих к эрозии и разрыву атеросклеротической бляшки, — вовлечены такие биомолекулы, как микро-РНК [1-6].

Микро-РНК представляют собой некодирующие одноцепочечные РНК длиной около 22 нуклеотидов [7]. Их экспрессия тканеспецифична и может отличаться в норме и при патологии, что подтверждается многочисленными экспериментальными исследованиями [3, 8]. В тканях человека обнаружено более 2500 микро-РНК, которые потенциально участвуют в регуляции до 60% белок-кодирующих генов [5, 9–11]. В свою очередь, экспрессия генов микро-РНК (обозначаются как MIR ) также подвергается регуляции, в том числе с помощью такого механизма, как метилирование ДНК. В ходе этого процесса метильная группа присоединяется к цитозину, связанному фосфодиэфирной связью с гуанином. Такие динуклеотиды называют CpG-сайтами [8, 12]. Как правило, избыточное метилирование (гиперметилирование) CpG-сайтов в области гена (преимущественно в промоторном регионе) подавляет транскрипцию и, следовательно, ингибирует экспрессию этого гена, а деметилирование (гипометилирование) способствует усиленной транскрипции [8, 10, 13].

Нарушение уровня метилирования генов часто выявляется при злокачественных новообразованиях, поэтому метилирование генов микро-РНК активно изучается при данных патологических состояниях [8, 10, 11, 14–16], в то время как исследования микро-РНК при атеросклерозе преимущественно посвящены анализу их экспрессии [17–19]. Так, согласно литературным данным, в клетках артерий, пораженных атеросклерозом, значительно усиливается экспрессия MIR21 [19].

Исследование уровня метилирования гена MIR10B проводилось в лаборатории популяционной генетики НИИ медицинской генетики ТНИМЦ. Показано, что метилирование MIR10B значительно отличается в клетках сосудов, пораженных атеросклерозом, по сравнению с клетками непораженных сосудов [20]. Однако не проводились исследования и отсутствуют литературные данные об уровне метилирования данных генов в лейкоцитах крови пациентов с клинически выраженным атеросклерозом сонных артерий по сравнению с лейкоцитами крови относительно здоровых индивидов. Также отсутствуют литературные данные о связи уровня метилирования генов MIR10B и MIR21 с факторами риска и признаками атеросклеротического поражения сосудов. Проведение такого анализа представляет значительный исследовательский интерес.

Цель работы: оценить связь уровня метилирования в промоторном и кодирующем регионах гена MIR10B и предполагаемом промоторном регионе MIR21 в лейкоцитах периферической крови с факторами риска и патогенетически значимыми признаками клинически выраженного атеросклероза сонных артерий.

Материал и методы

Выборка больных с клинически выраженным атеросклерозом сонных артерий составила 122 пациента в возрасте от 40 до 83 лет (в среднем 64 года), из них 107 мужчин и 15 женщин. У всех пациентов обнаружен стеноз сонной артерии >70%, в связи с чем им была про- ведена операция каротидная эндартерэктомия. Также у всех пациентов наблюдалась артериальная гипертензия. Гиперхолестеринемия обнаружена у 91 пациента (74,6%), сахарный диабет 2-го типа выявлен у 36 (29,5%) больных. Факт курения в анамнезе отмечался у 93 (76,23%) пациентов. Острое нарушение мозгового кровообращения в анамнезе выявлено у 55 (45%) пациентов. В данной группе образцы периферической крови были взяты до оперативного вмешательства.

В контрольную группу вошли 135 относительно здоровых индивидов в возрасте от 38 до 84 лет (в среднем 63 года), из них 103 мужчины и 32 женщины. У всех индивидов при ультразвуковом исследовании сонных артерий не было выявлено гемодинамически значимых атеросклеротических бляшек (толщина КИМ справа — 0,84±0,20 мм и слева — 0,88±0,23 мм); стеноз правой и/ или левой сонной артерии не превышал 40%.

Данное исследование одобрено этическим комитетом, и от всех участников получено письменное информированное согласие. Биологический материал хранился при температуре –80 °C до проведения молекулярного анализа.

Молекулярно-генетические методы исследования включали выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, бисульфитную модификацию ДНК, полимеразную цепную реакцию на участки генов MIR10B и MIR21 и пиросеквенирование этих участков с определением уровня метилирования расположенных в них CpG-сайтов. Выделение ДНК проводилось с использованием стандартного фенол-хлороформного метода с ее последующей бисульфитной конверсией с помощью набора EZ DNA Methylation™ Kit (Zymo Research).

Последовательность праймеров для анализа уровня метилирования отдельных CpG-сайтов в области промотора MIR10B взята из публикации Kim Y. S. и соавт. [14], а в области промотора MIR21 — Adams A. T. и соавт. [15]. Праймеры на кодирующий регион гена MIR10B были подобраны в более ранних исследованиях лаборатории популяционной генетики НИИ медицинской генетики ТНИМЦ [12, 20].

Уровень метилирования ДНК проанализирован методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 (Qiagen) для 4 CpG-сайтов, принадлежащих промоторно-му региону гена MIR10B, 4 CpG-сайтов, принадлежащих кодирующей области гена MIR10B и 3 CpG-сайтов, относящихся к промоторному региону гена MIR21 . Координаты CpG-сайтов приведены для сборки генома GRCh37/ hg19. Для каждого образца получены количественные данные об уровне метилирования каждого изучаемого CpG-сайта. Метилирование выражается в процентах, где 0% указывает на наличие только неметилированных аллелей, а 100% — на полное метилирование всех CpG-сайтов в данном положении.

Статистический анализ данных, полученных как для каждого CpG-сайта в отдельности, так и регионов в целом, проводился в свободно распространяемом программном обеспечении PSPP. В этой же программе осуществлялся анализ ассоциации уровня метилирования генов MIR10B и MIR21 со всеми факторами риска и признаками, относящимися к клинической информации о пациентах. Сравнение уровней метилирования CpG-сайтов между группами выполнено с использованием критерия Манна — Уитни. Для изучения корреляции между измеряемыми величинами использовался непараметрический тест ранговой корреляции Спирмена. Контроль ложноположительных результатов (FDR) при множественном тестировании статистических гипотез был проведен по методу Бенджами-ни — Хохберга с использованием поправки к полученным значениям p на уровне значимости 0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования выявлено, что уровень метилирования обоих проанализированных регионов гена MIR10B (как отдельных CpG-сайтов, так и регионов в целом) в лейкоцитах больных атеросклерозом на 2–4% выше ( p <0,05), чем в лейкоцитах индивидов контрольной группы (табл. 1).

Таблица 1

Уровень метилирования CpG-сайтов исследованных регионов генов MIR10B и MIR21 (Q2 [Q1;Q3]; %)

Анализируемые CpG-сайты (локализация по GRCh37/hg19)	Уровень метилирования CpG-сайтов в лейкоцитах		Уровень значимости p
	больных атеросклерозом	контрольной группы
chr2:177014950	27 [24;33]	24 [20;30]	0,012
chr2:177014960	22 [17;26]	19 [15;21]	0,001
chr2:177014963	24 [21;29]	22 [20;25]	0,002
chr2:177014967	20 [16;25]	17 [15;21]	0,010
Промоторный регион MIR10B в целом	24 [20;27]	20 [18;24]	<0,001
chr2:177015044	12 [10;17]	14 [13;15]	0,282
chr2:177015070	17 [13;20]	16 [15;17]	0,014
chr2:177015088	33 [27;38]	31 [30;33]	0,001
chr2:177015104	17 [14;22]	20 [17;21]	0,384
Кодирующая область MIR10B в целом	21 [16;25]	20 [17;21]	0,023
chr17:57915717	34 [28;40]	31 [27;37]	0,023
chr17:57915741	19 [16;22]	18 [16;21]	0,707
chr17:57915774	36 [27;41]	37 [25;43]	0,523
Промоторный регион MIR21 в целом	29 [25;34]	29 [23;32]	0,054

Примечание: курсивом выделен уровень значимости p <0,05, полужирным — p <0,01, полужирным курсивом — p<0,001.

Уровень метилирования CpG-сайта гена MIR21, расположенного в регионе сhr17:57915717, в лейкоцитах крови пациентов с атеросклерозом сонных артерий также оказался выше, чем у здоровых индивидов (p<0,05) (табл. 1). Сравнение уровней метилирования других CpG-сайтов промоторного региона гена MIR21 не показало статистически значимых отличий между лейкоцитами больных атеросклерозом и здоровых индивидов.

При сравнении уровня метилирования изучаемых генов у пациентов с атеросклерозом в зависимости от наличия сахарного диабета 2-го типа (СД2) средний уровень метилирования анализируемого CpG-сайта гена MIR21 (сhr17:57915717) в лейкоцитах при СД2 оказался на 3,75% выше, чем у пациентов с атеросклерозом, но без данного заболевания (35,00 против 31,25%; p <0,05).

В лейкоцитах больных атеросклерозом сонных артерий уровни метилирования всех CpG-сайтов промотора MIR21 показали отрицательную статистически значимую корреляцию с уровнем общего холестерола в сыворотке крови. Для отдельных CpG-сайтов гена MIR10B и его кодирующего региона в целом была показана слабая положительная корреляция с курением (табл. 2). Значимых ассоциаций уровня метилирования СpG-сайтов генов MIR10B и MIR21 с другими показателями (как количественными, так и качественными) атеросклеротического поражения сонных артерий не установлено.

Таблица 2

Корреляции уровней метилирования CpG-сайтов исследованных регионов генов MIR10B и MIR21 с показателями атеросклероза (приведены только значимые корреляции)

Анализируемые CpG-сайты (локализация по GRCh37/hg19)	Коэффициент корреляции Спирмена r	Уровень значимости p
Курение
chr2:177014960	0,213	0,029
chr2:177015088	0,283	0,005
Кодирующая область MIR10B в целом	0,211	0,038
Уровень холестерола в сыворотке крови
chr17:57915717	–0,359	<0,001
chr17:57915741	–0,303	0,003
chr17:57915774	–0,338	0,001
Промоторный регион MIR21 в целом	–0,361	<0,001

Примечание: курсивом выделен уровень значимости p <0,05, полужирным — p <0,01, полужирным курсивом — p <0,001.

Поскольку метилирование ДНК является относительно стабильной модификацией, а оценка его уровня возможна при помощи нескольких доступных технологий, это позволяет говорить о перспективности использования уровня метилирования генов в качестве диагностического и прогностического биомаркера. Данные, полученные в описанном исследовании, могут предоставить информацию для исследований в направлении выявления новых биомаркеров атеросклеротического поражения сосудов и разработки диагностических панелей. Тем не менее для решения подобной масштабной задачи требуется продолжение фундаментальных исследований, посвященных анализу связи регуляции экспрессии (в том числе посредством метилирования) генов микро-

РНК с факторами риска и патогенетически значимыми признаками атеросклероза.

Выводы

Уровень метилирования ДНК в области генов MIR10B и MIR21 в лейкоцитах крови ассоциирован с риском развития клинически выраженного атеросклероза сонных артерий. У пациентов с атеросклерозом сонных артерий в лейкоцитах выявлена связь уровня метилирования промотора гена MIR21 с сахарным диабетом 2-го типа и уровнем холестерола в сыворотке, а кодирующего региона гена MIR10B — с курением.