Анализ влияния бифенила, хлор/хлоргидроксибифенилов и продуктов их биотрансформации на иммунный ответ и морфофункциональное состояние печени

Проблема токсического воздействия на организм человека и животных соединений органического синтеза является одной из наиболее актуальных в настоящее время. Особое внимание уделяется веществам, включенным, согласно Стокгольмской конвенции, в группу стойких органических загрязнителей (СОЗ), а также их производным, образующимся под действием природных экосистем [Final act ..., 2001]. Анализ научных библиотек, в том числе PubMed и Web of Science, за период с 2015 по 2021 гг. по ключевым словам «полихлорированные бифенилы» (входят в группу СОЗ), «ПХБ», «Aroclor» выявил более 60 тысяч научных сообщений, среди них 1586 статей, посвященных изучению влияния ПХБ и их производных на организм человека и животных [Carlson et al., 2023].

ПХБ – группа веществ 2 класса опасности, состоящая из 209 соединений, отличающихся количеством хлорных заместителей в молекуле и их расположением. ПХБ выпускались в промышленных масштабах в виде коммерческих смесей, содержащих 40–70 конгенеров [Erickson, Kaley, 2011]. Область применения ПХБ была чрезвычайно широкой, что привело к загрязнению данными веществами обширных территорий. Характерными особенностями ПХБ являются устойчивость к воздействию внешних факторов среды, растворимость в органических растворителях (в том числе в жирах), способность к биоаккумуляции и сорбции на различных поверхностях [Murinová, Dercová, 2014; Reddy et al., 2019; Devi, 2020].

Рядом исследований установлено, что ПХБ поступают в организм животных и человека, поднимаясь по пищевым цепям, а также в ингаляционной форме при проникновении в организм с мелкими частицами пыли [Frossard et al., 2023; Simpson et al., 2024; Ling et al., 2024]. Кроме того, дети, проживающие на территориях с высоким уровнем загрязнения, в первые годы жизни получают ПХБ с молоком матери [Guo et al., 2023]. ПХБ негативно влияют практически на все органы и системы человека и животных. Известно, что хроническое отравление ПХБ приводит к нарушениям нервной, репродуктивной и иммунной систем, генетическим поражениям, канцерогенезу [Spector et al., 2014; Ermler et al., 2022; Carlson et al., 2023; Guo et al., 2023; Tam et al., 2023; Miletić et al., 2023; Wu et al., 2024].

В последнее время появились данные о возможной природной трансформации ПХБ до гидроксипроизводных, которые являются вторичными поллютантами [Camara et al., 2004; Passatore et al., 2014; Tehrani, Van Aken, 2014; Sun et al., 2016, 2018; Li et al., 2019]. Находясь длительное время в почве, ПХБ выступают селективным фактором для отбора микроорганизмов, обладающих ферментативными системами окисления данных веществ. Под воздействием специфичных моно- и диоксигеназ, выявленных у штаммов родов Pseudomonas , Rhodococcus , Burkholderia и ряда других, происходит образование моно-или дигидроксилированных производных ПХБ [Parales, Resnick, 2006; Fukuda, 2014; Goto et al., 2018; Sun et al., 2018; Agulló et al., 2019]. Показано, что в организме человека также возможно образование моногидроксипроизводных ПХБ [Ludewig 2013; Yabu et al., 2022]. Период полувыведения гидроксилированных производных сопоставим с таковым для исходных ПХБ (от 1 до 20 лет) [Rengelshausen et al., 2023]. При этом данные вещества не менее опасны для человека и животных, чем негидроксилированные ПХБ [Ludewig 2013; Rengelshausen et al., 2023].

В большинстве работ показано, что негативный эффект оказывают либо смеси ПХБ, либо высокохло-рированные бифенилы. Так, на примере популяции, длительно проживающей на ПХБ-загрязненной территории, показано, что иммуносупрессия развивается в результате снижения пролиферации Т-лимфоцитов под воздействием смеси ПХБ [Hall et al., 2018]. Присутствие в организме ПХБ 126 (пен-тахлорированный бифенил) вызывало снижение функций гуморального и клеточноопосредованного иммунитета [Duffy et al., 2002]. Однако остается открытым вопрос о влиянии низкохлорированных бифенилов и их производных на отдельные органы и системы млекопитающих.

Цель работы – оценить влияние бифенила и его производных, содержащих 1-2 хлор- и/или гидрко-сигруппы, на показатели гуморального и клеточноопосредованного иммунитета, а также на гистологическую картину печени до и после микробной трансформации штаммом Rhodococcus ruber P25.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования служили мыши породы Swiss, массой приблизительно 18–23 г обоих полов. Животные содержались в условиях лабораторного вивария с 12-часовым циклом освещения, двухразовым питанием натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам, при неограниченном доступе к воде. Эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациями и этическими нормами, указанными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» [Страсбург,1986].

Штамм-деструктор Rhodococcus ruber P25 (ВКМ Ас-3025, ИЭГМ896) – представитель аэробных, грамположительных, неспорообразующих, неподвижных бактерий, характеризующийся высокой биоде-градативной активностью в отношении хлорированных и гидроксилированных бифенилов [Плотникова и др., 2012; Egorova et al., 2020, Gorbunova et al., 2021].

В работе использованы аналитически чистые (>98%) бифенил («ACROS-Organics», США), 3,4-дихлорбифенил (ПХБ 12) (ИОС УрО РАН, Россия), смесь Р (в составе 3-хлорбифенил, 4-хлорбифенил, 3-гидрокси-4-хлорбифенил, 4-гидрокси-3-хлорбифенил) (ИОС УрО РАН, Россия) (табл. 1) [Егорова и др., 2021].

Таблица 1

Химическая характеристика исследуемых соединений [Chemical characterization of the studied compounds]

Наименование	Молекулярная формула	Структурная формула	Молярная масса, г/моль	Растворимость
				Н 2 О	жиры
Бифенил	С 12 H 10	vj\=/	154.21	–	+
ПХБ 12	C 12 H 8 O 2	Cl Cl	223.10	–	+

Смесь Р

X© о4 ОО ^	ПХБ 2	C 12 H 9 Cl	Cl		188.66	–	+
	ПХБ 3	C 12 H 9 Cl	Cl с	"Л    7	188.66	–	+
х© об о.	3-гидрокси- 4-хлорбифенил	C 12 H 9 ClO	HO Cl		204.66	±	+
	3-хлор-4-гидрокси-бифенил	C 12 H 9 ClO	Cl HO vT"		204.66	±	+

Бактериальную деструкцию бифенила, ПХБ 12 и смеси Р проводили согласно [Egorova et al., 2020]. Культуральную среду с продуктами деградации очищали от бактериальных клеток центрифугированием (центрифуга miniSpin, «Eppendorf», Германия) при 10 000 об/мин в течение 3 мин. Метаболиты деструк- ции бифенила и его хлор(гидрокси)производных определяли в культуральной жидкости методами спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии согласно [Egorova et al., 2020; Егорова и др., 2021]. Присутствие исходных соединений контролировали методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором согласно [Egorova et al., 2020; Егорова и др., 2021]. Отбор культуральной среды производили на 7 и 14 сутки культивирования.

Моделирование метаболических путей трансформации бифенила, ПХБ 12 и соединений, входящих в состав смеси Р, осуществляли на основании полученных экспериментальных результатов и международных баз данных: Brenda , KEGG , ExplorEnz , GenBank . Для визуализации метаболических путей использован пакет программ ACDLabs Freeware.

В ходе работы оценивали воздействие бифенила, ПХБ 12, смеси Р, а также продуктов их бактериальной деструкции, присутствующих в культуральной среде на 7 и 14 сутки, на показатели адаптивного и врожденного иммунитета.

Исследуемые вещества вводили мышам перорально, в кукурузном масле, последовательно, через день, в дозировке 100 мг/кг, в течение 24 дней. Выбор дозировки основан на материалах литературных источников [Руководство …, 2012].

Мыши были разделены на следующие группы:

• 1-я группа – контрольная, мышам из этой группы перорально вводили чистое кукурузное масло;

• 2-я группа – вводили перорально бифенил (подгруппа А), в кукурузном масле, и продукты его микробной деструкции (подгруппа Б – 7 суток деструкции, подгруппа В – 14 суток деструкции);

• 3-я группа – вводили перорально ПХБ 12 (подгруппа А), в кукурузном масле, и продукты его микробной деструкции (подгруппа Б – 7 суток деструкции, подгруппа В – 14 суток деструкции);

• 4-я группа – вводили перорально смесь Р (подгруппа А), в кукурузном масле, и продукты ее микробной деструкции (подгруппа Б – 7 суток деструкции, подгруппа В – 14 суток деструкции).

На 19-ый день эксперимента животных иммунизировали эритроцитами барана в брюшную полость в концентрации 108 клеток в 200 мкл физиологического раствора для индукции гуморального иммунитета в селезенке. На 24-ый день мышам вводили разрешающую дозу эритроцитов барана под кожу левой стопы и аналогичный объем физиологического раствора (0,9%-ный раствор NaCl), под кожу правой стопы, для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). На 25-ый день животных выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Гуморальный иммунный ответ оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза в геле агарозы по методу Ерне [Jerne, Nordin, 1963]. Выраженность реакции ГЗТ оценивали путем измерения отека лапы по индексу массы.

Для оценки гистологического состояния печени орган фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7.2) и заливали в парафин «Гистомикс». Гистологические препараты готовили по стандартным гистологическим методикам. Для оценки общей морфологической картины срезы (толщина 4–5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде средней и стандартной ошибки (M±m).

Результаты и их обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что незамещенный бифенил снижает количество АОК в селезенке по относительным показателям (Log10АОК/млн) (табл. 2). Появление двух атомов хлора у 3 и 4 углеродных атомов одного из колец молекулы бифенила (ПХБ 12) приводит к увеличению токсичности соединения, что выражается в угнетении антителогенеза по всем исследуемым показателям, в том числе в снижении количества ядросодержащих клеток (ЯСК/орган) (табл. 2). Отметим, что смесь Р, в составе которой присутствуют монохлорированные и монохлор-моногидроксипроизводные бифенила, не оказывает влияния на количество антителообразующих клеток, однако достоверно снижает количество ядросодержащих клеток (табл. 2).

Как видно из табл. 2, деградация бифенила и ПХБ 12 в течение 7 суток штаммом Rhodococcus ruber P25 (R. ruber Р25) (табл. 2) не приводила к изменению направленности эффекта в отношении количества АОК в селезенке, оно оставалось сниженным по сравнению с контролем как по абсолютным, так и по относительным показателям, однако нивелировала индуцированное ПХБ 12 и смесью Р угнетение в селезенке количества ядросодержащих клеток.

После 14 суток деградации исследуемых соединений штаммом R. ruber P25 метаболиты ПХБ 12 и бифенила продолжали оказывать угнетающе влияние на количество антителообразующих клеток, а также ПХБ 12 снижал клеточность селезенки. Помимо этого, метаболиты после14 суток деградации смеси Р штаммом R. ruber Р25 достоверно снижали в селезенке количество ядросодержащих клеток.

Таблица 2

Влияние бифенила, ПХБ 12, смеси Р и продуктов их микробной деградации на количество АОК в селезенке

[The effect of biphenyl, PCB 12, mixture of P and products of their microbial degradation on the amount of PFC (plaque forming cells) in the spleen]

Воздействие	Log 10 АОК/млн	Log 10 АОК/орг	ЯСК/орган
До биодеструкции
Контроль (n=8)	2.40±0.05	4.90±0.07	348.00±31.99
Бифенил (n=8)	2.05±0.19*	4.40±0.17	277.60±33.85
ПХБ 12 (n=6)	1.90±0.16*	4.30±0.13*	229.44±35.67*
Смесь Р (n=8)	2.40±0.05	4.80±0.05	228.15±11.23*

7 сут деструкции

Контроль (n=15)	2.43±0.04	4.71±0.08	235.41±36.94
Бифенил (n=8)	1.54±0.32*	3.73±0.23*	176.20±37.67
ПХБ 12 (n=10)	1.50±0.34*	3.75±0.32*	190.40±36.74
Смесь Р (n=8)	2.02±0.20	4.33±0.20	205.87±23.23

14 сут деструкции

Контроль (n=8)	2.29±0.12	4.62±0.14	235.40±36.45
Бифенил (n=8)	1.77±0.34	3.98±0.19*	196.16±87.83
ПХБ 12 (n=8)	1.62±0.40	3.53±0.42*	81.92±4.84*
Смесь Р (n=8)	2.18±0.27	4.19±0.28	105.92±9.70*

Примечание: АОК ─ антителообразующие клетки. *p < 0.05 по сравнению с контролем по непарному t-критерию Стьюдента.

При анализе влияния бифенила, ПХБ 12, смеси Р и продуктов их микробной деградации на клеточноопосредованный иммунитет (табл. 3) были получены следующие результаты. Бифенил, ПХБ 12 и продукты их биодеградации не влияли на выраженность реакции ГЗТ, в то же время введение мышам смеси Р приводило к стимуляции данного показателя по сравнению с контрольными животными. Разложение смеси Р штаммом R. ruber Р25 в течении как 7, так и 14 суток приводило к нивелированию стимулирующего действия соединений смеси.

Таблица 3

Влияние бифенила, ПХБ 12, смеси Р и продуктов их микробной деградации на выраженность реакции ГЗТ в селезенке

[The effect of biphenyl, PCB 12, mixture of P and products of their microbial degradation on the severity of the DTH reaction in the spleen]

Индекс реакции (%)	Контроль	Бифенил	ПХБ12	Смесь Р
Без деградации	23.63±1.85	28.55±3.14	22.69±2.01	32.84±3.94*
7 сут	24.52±2.67	29.35±3.27	32.58±3.77	24.18±3.30
14 сут	23.61±5.65	11.96±4.81	13.327±2.81	17.76±3.02

Примечание: *p < 0.05 по сравнению с контролем по непарному t-критерию Стьюдента.

В результате анализа культуральной среды установлено, что при биодеструкции бифенила детектируется только бензойная кислота (БК) (табл. 4). Однако при разложении ПХБ 12 и смеси Р в среде обнаруживаются гидрокси-оксо-фенил-гексадиеновые кислоты (ГОФДК) с заместителями в положениях, соответствующих начальному субстрату, хлорбензойные (ХБК), хлор-гидрокси-бензойные (ХГБК) и пентадиеновые (ПДК) кислоты. Полученные данные согласуются с опубликованными ранее [Егорова и др., 2021].

Полученные в настоящем исследовании и опубликованные ранее данные позволяют утверждать, что штамм R. ruber P25 осуществляет разложение исследуемых соединений по классическому «верхнему» бифенильному пути (рис. 1, 2) [Егорова и др., 2021].

Несмотря на то, что к 7 суткам деструкции количество бифенила и ПХБ 12 существенно снизилось (табл. 4), токсический эффект сохранялся (табл. 2). Можно предположить, что появление дигидроксипроизводных бифенила/хлорбифенила и (хлор)бензойных кислот (ХБК/БК) вносит свой вклад в подавление процессов антителогенеза. При воздействии на организм мышей продуктами 14-ти дневной деструкции бифенила и ПХБ 12 токсический эффект сохраняется только для метаболитов ПХБ 12 (табл. 2). Исходное соединение в смеси отсутствует, однако зафиксировано значительное количество промежуточных продуктов, в том числе гидроксилированных метаболитов (табл. 4, рис. 2), что подтверждает высказан- ное ранее предположение о токсичности образующихся при биотрансформации бифенила/ПХБ промежуточных соединений [Camara et al., 2004; Passatore et al., 2014; Tehrani, Van Aken, 2014; Sun et al., 2016, 2018; Li et al., 2019].

Таблица 4

Эффективность деструкции и формирование метаболитов при биотрансформации бифенила и его производных

H

OH

COOH

CH 2 COOH

бифенил 2,3-дигидроксибифенил

ГОФДК

бензойная кислота

ПДК

Рис. 1. Схема метаболического пути деструкции бифенила штаммом R. ruber P25 [Scheme of the metabolic pathway of biphenyl destruction by the R. ruber strain P25]

[The efficiency of destruction and formation of metabolites during biotransformation of biphenyl and its derivatives]

Субстрат	Время, сут	Деструкция, %	Основные метаболиты
			ГОФДК, о.е.	БК/ХБК/ХГБК
бифенил	7	97	0	0.1 мг/л
	14	100	0	0.3 мг/л
ПХБ 12	7	95	λ 438 = 0.120	0.2 мг/л
	14	100	λ 438 = 0.285	0.4 мг/л
Смесь Р	7	88	λ 436 = 0.112 λ 438 = 0.268	5.2×107 мВ·с
	14	100	λ 418 = 0.134 λ 438 = 0.382	4.4×107 мВ·с

Рис. 2. Схема метаболического пути деструкции ПХБ 12 штаммом R. ruber P25 [Егорова и др., 2021] [Scheme of the metabolic pathway of PCB 12 destruction by the R. ruber strain P25 [Егорова и др., 2021]]

Трансформация компонентов смеси Р происходит через стадии образования ди- и тригидроксилирован-ных продуктов (рис. 3). Интересно отметить, что смесь Р, содержащая монохлорированные и монохлормоногидрокси-бифенилы, угнетала образование ядросодержащих клеток в селезенке, не влияя на АОК, и стимулировала реакцию клеточноопосредованного иммунитета (табл. 2). Через 7 суток деструкции количество смеси Р снижается до 12% от исходного содержания, что приводит к нивелированию ранее отмеченных эффектов. Однако через 14 суток, когда в среде присутствуют только метаболиты бактериальной деструкции смеси Р, вновь отмечается угнетение в селезенке количества ядросодержащих клеток (табл. 2, 4). Данное явление может быть следствием накопления метаболитов, в том числе хлор-гидрокси-бензойных кислот, гидрокси-пентадиеновых кислот, гидроксилированных ГОФДК и тригидрокси-хлорбифенилов (рис. 3, табл. 4). Известно, что гидроксилирование продуктов биотрансформации ПХБ приводит к увеличению их водорастворимости и чувствительности к ряду детоксицирующих ферментных систем [Haraguchi et al., 1997; Yabu et al., 2022]. Однако ферменты окисления производных ПХБ у разных видов млекопитающих отличаются по активности к одному и тому же конгенеру ПХБ и его метаболитам [Yabu et al., 2022]. Данный факт вносит дополнительные трудности при интерпретации данных о токсичности тех или иных продуктов биодеструкции ПХБ для отдельных видов млекопитающих.

COOH

Cl

3-хлор-         3-хлор-

ГОФДК       бензойная кислота

CH 2 COOH

ПДК

ПХБ 2        3-хлор-

3-хлор-    2',3'-дигидрокси- бифенил      бифенил

ПХБ 3      4-хлор-

4-хлор-  2',3'-дигидрокси- бифенил     бифенил

Cl

4-хлор-ГОФДК

COOH

4-хлор-бензойная кислота

CH 2 COOH

ПДК

Cl

3-гидрокси-4-хлорбифенил

3-гидрокси-4-хлор-ГОФДК

3,2',3'-тригидрокси-4-хлорбифенил

3-гидрокси-4-хлор-бензойная кислота

COOH

ПДК

3-хлор-4-гидрокси-

ГОФДК

3-хлор-4-гидроксибифенил

3-хлор-2',3',4-тригидрокси-бифенил

COOH

+

Cl

OH

3-хлор-4-гидрокси-бензойная

CH 2 COOH

ПДК

кислота

Рис. 3. Схема путей биодеструкции компонентов смеси Р штаммом R. ruber P25

[Scheme of the biodegradation pathways of the components of the P mixture by the R. ruber strain P25]

В работе [Rengelshausen et al., 2023] отмечено, что низкохлорированные бифенилы и их метаболиты могут циркулировать в клетках печени. Кроме того, низкохлорированные конгенеры ПХБ способны инициировать гепатокарциногенез у млекопитающих [Ludewig et al., 2013].

В настоящем исследовании установлено, что на фоне перорального введения бифенила, ПХБ 12 и смеси Р в печени имела место гистоморфологическая картина хронического гепатита (рис. 4), фиксировалась распространенная «пылевидная» и мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов, очаговая гидропическая (центролобулярная) дистрофия гепатоцитов. В сосудах портальной системы имелись признаки застоя клеток крови. В части центральных вен долек печени наблюдались признаки выраженного переполнения кровью, явления гемолиза эритроцитов. Эндотелий был несколько увеличен в объеме, что свидетельствует о его гипертрофии. Целостность сосудистых стенок сохранена. Явлений диапедеза, геморрагий нет. Верифицируются участки периваскулярной лимфогистиоцитарной инфильтрации.

А

Б

В

Г

Рис. 4. Структура печени в контрольной группе (А), под воздействием бифенила (Б), ПХБ 12 (В) и смеси Р (Г). Ув. 400

[The structure of the liver in the control group (A), under the influence of biphenyl (B), PCB 12 (C) and the P mixture (D). Magnification 400]

После 7 суток деградации штаммом R. ruber Р25 под воздействием образовавшихся метаболитов всех исследуемых соединений в печени сохранялась распространенная белковая дистрофия гепатоцитов с гидратацией цитоплазмы; мелкоочаговые дегенеративные изменения ядер гепатоцитов; повышенная пролиферативная активность гепатоцитов (рис. 5).

Рис. 5. Структура печени в контрольной группе (А), под воздействием бифенила (Б), ПХБ 12 (В) и смеси Р (Г) после 7 суток деградации штаммом R. ruber Р25. Ув. 400

[The structure of the liver in the control group (A), under the influence of biphenyl (B), PCB 12 (B) and the P mixture (G) after 7 days of degradation by the R. ruber strain P25. Magnification 400]

После 14 суток деградации штаммом R. ruber Р25 под воздействием образовавшихся метаболитов всех исследуемых соединений мы продолжаем наблюдать в печени распространенную белковую дистрофию гепатоцитов, мелкие фокусы некроза отдельных гепатоцитов и групп гепатоцитов без некровос-палительной реакции, выраженный анизокариоз и увеличение количества двуядерных гепатоцитов в центральных областях печеночных долек (рис. 6).

А

Б

В

Г

Рис. 6. Структура печени в контрольной группе (А), под воздействием бифенила (Б), ПХБ 12 (В) и смеси Р (Г) после 14 суток деградации штаммом R. ruber Р25. Ув. 400

[The structure of the liver in the control group (A), under the influence of biphenyl (B), PCB 12 (B) and the P mixture (G) after 14 days of degradation by the R. ruber strain P25. Magnification 400]

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что бифенил, ПХБ 12 и продукты их биодеструкции, образованные под воздействием ферментативных систем штамма Rhodococcus ruber P25, оказывают угнетающее действие на гуморальный иммунитет млекопитающих. Напротив, смесь Р, представленная смесью монохлорированных и монохлор-моногидроксилированных бифенилов, не оказывала влияния на гуморальный иммунитет, однако стимулировала клеточноопосредованный ответ. Стоит отметить, что трансформация компонентов смеси Р штаммом R. ruber P25 приводила к нивелированию выявленных эффектов в отношении иммунных реакций млекопитающих. Установлено, что бифенил, ПХБ 12 и смесь Р вызывают развитие хронического гепатита с признаками дистрофии гепатоцитов. Под воздействием метаболитов, образованных при трансформации бифенила, ПХБ 12 и смеси Р штаммом R. ruber P25, в печени образуются дистрофические изменения в гепатоцитах (без некровоспалительной реакции), при этом развивались признаки репаративной регенерации.