Анализ встречаемости девяти мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком молочной железы в Сибирском регионе

Рак молочной железы (РМЖ) – cамое частое онкологическое заболевание у женщин. Примерно каждая десятая жительница развитых стран заболевает РМЖ. Рак яичника (РЯ) встречается несколько реже, однако он занимает лидирующие позиции по онкогинекологической смерт- ности, в основном вследствие несовершенства ранней диагностики. От 5 до 10 % случаев РМЖ и РЯ являются наследственными. Считается, что до 30–50 % из них обусловлены мутациями, наследуемыми по аутосомно-доминантному признаку, в генах BRCA1 (MIN 113705) и BRCA2

(MIN 600185), локализованных соответственно на хромосомах 17q21 и 13q12 [16]. По литературным данным, повреждающие мутации в данных генах проявляют высокую пенетрантность и приводят к развитию этих онкологических заболеваний с вероятностью до 80–90 % в течение жизни женщины [14, 18]. Случаи го-

Рис. 1. Генотипирование по сайтам мутаций в генах BRCA1/2 с помощью тетрапраймерной ПЦР. St – маркеры молекулярной массы ДНК. Генотипирование по сайтам: 1 – S1099X BRCA2;

2 – 2963del10 BRCA1; 3 – 3819de5 BRCA1; 4 – 185delAG BRCA1; 5 – 9318delAAAA BRCA2; 6 – 3875del4 BRCA1;

7 – 5382insC BRCA1; 8 – 1528delAAAA BRCA2; 9 – 4153delA BRCA1. Образец не содержал исследованных мутаций

Рис. 2. Идентификация мутаций 5382insC и 185delAG в гене BRCA1 человека:

А – анализ мутации 5382insC: 1, 2, 3 – гомозиготные образцы без мутации; 4 – гетерозиготный образец ДНК с мутацией;

5 – маркеры молекулярной массы ДНК;

Б – анализ мутации 185delAG: 1 – маркеры молекулярной массы ДНК; 2, 4 – гомозиготные образцы без мутации;

3 – гетерозиготный образец ДНК с мутацией мозиготного носительства данных мутаций не описаны, по всей видимости, при гомозиготном носительстве мутаций происходит внутриутробная гибель зародыша [2].

Смысл анализа мутаций – в выявлении групп высочайшего риска онкологических заболеваний среди здоровых людей. Здоровые люди, носители таких мутаций, должны находиться под самым пристальным наблюдением онколога, обязательно проходить маммографию, использовать другие существующие способы раннего обнаружения опухолей, принимая во внимание крайне высокую вероятность возникновения раковой опухоли. В США и в ряде европейских стран здоровым людям – носителям мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 рекомендуют делать профилактические операции до возникновения опухоли (офорэктомию и мастэктомию), особенно женщинам старше детородного возраста [12]. На сегодняшний день профилактические операции становятся достаточно принятой процедурой за рубежом для генетически отягощенных женщин. Женщины-носительницы BRCA1 мутаций особенно подвержены развитию РМЖ и РЯ в раннем возрасте (до 40 лет) с вероятностью 45–60 % и 20–40 % соответственно. Мутации в BRCA2 повышают риск раннего развития РМЖ и РЯ до 25–40 % и 10–20 % соответственно [8, 9, 15].

Следует отметить, что спектр наследственных мутаций в генах BRCA1/2 специфичен для разных стран и этнических групп. В отдельных популяциях могут преобладать вполне определенные мутации [10]. В России разнообразие мутаций в гене BRCA1 не так велико, как это было описано для США и ряда европейских стран. Высказано (и отчасти доказано в работах) предположение, что большую часть наследственных мутаций в генах BRCA1/2 в России составляют 12–14 мутаций [1, 3].

В данной работе мы провели анализ встречаемости 9 мутаций в генах BRCA1/2 у пациентов с диагнозом РМЖ, с целью выявления наиболее часто встречающихся мутаций, которые повышают риск развития данного заболевания.

Материал и методы

В работе использовали образцы буккального эпителия (48 образцов) и крови (288 образец)

О.Б. ЧАСОВНИКОВА, Д.В. МИТРОФАНОВ, Д.О. ДЕМЧЕНКО И ДР.

Размеры амплификационных фрагментов при тетрапраймерной ПЦР

Таблица

Анализируемые мутации Длины фрагментов, п.н. ДНК «дикого типа» ДНК, содержащая мутацию 3 185delAG 291, 215 291, 115 5382insC 356, 164 356, 229 4153delA 349, 269 349, 125 2963del10 269, 130 269, 178 3819del5 239, 189 239, 90 3875del4 279, 211 279, 101 9318delAAAA 395, 263 395, 173 1528delAAAA 273, 141 273, 182 S1099X 300, 146 300, 203 пациентов онкодиспансера г. Кемерова, а также крови пациентов РМЖ 1-й Городской клинической больницы г. Новосибирска (259 образцов). Все пациентки имели диагноз рак молочной железы и проходили стационарное лечение. Возраст женщин варьировал от 18 до 81 года. Средний возраст составил 53,5 ± 12,8 года.

Образцы геномной ДНК. Выделение ДНК проводили с использованием наборов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» (Promega, США). Выделение проводили согласно рекомендациям производителя. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК оценивали спектрофотометрически на спектрофотометре «Agilent 8450A» (Agilent Technologies, США). Генотипирование на мутации в генах BRCA1/2 проводили методом тетрапраймерной ПЦР [20] с использованием наборов «GenePak^TM mut/wt DNA PCR test» («Лаборатория Изоген», Москва) согласно рекомендациям производителя. В качестве матрицы использовали 5–10 нг геномной ДНК. Продукты амплификации визуализировали электрофорезом в 3 % агарозном геле.

Результаты и обсуждение

Во многих исследованиях показано, что повреждающие мутации в генах BRCA1/2 ассоциированы с развитием РМЖ и РЯ. Для анализа были выбраны мутации 5382insC, 185delAG, 2963del10, 3819del5и 3875del4 в гене BRCA1 , а также мутации 9318delAAAA, 1528delAAAA и S1099X в гене BRCА2 , ранее зарегистрированные российскими авторами [1, 5, 17]. Для проведения молекулярно-генетического тестирования образцов ДНК больных РМЖ использо- СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №5 (41)

вали тетрапраймерную аллель-специфическую ПЦР [20].

При наличии в реакционной смеси ДНК «дикого типа» (без данной конкретной мутации) синтезируются два фрагмента ДНК различной длины. В случае гетерозиготного образца, который содержит как ДНК «дикого типа», так и ДНК с мутацией, появляется дополнительный фрагмент ДНК. В таблице приведены мутации в генах BRCA1/2 , которые были проанализированы. Показаны размеры фрагментов, которые образуются при наличии в реакционной смеси ДНК «дикого типа» (рис. 1) и ДНК, содержащей соответствующую мутацию.

В ходе работы образцы ДНК 595 пациенток с диагнозом рак молочной железы были тестированы на наличие 9 мутаций в генах BRCA1/2 . Из общего числа больных 11 человек (1,85 %) оказались носителями мутации 5382insC (рис. 2А). Таким образом, частота встречаемости аллеля BRCA1 5382insC в исследованной группе больных раком молочной железы составила 0,0092.

Более высокая частота носительства данной мутации (4,5 %) была получена при обследовании 64 анонимных образцов ДНК от женщин, больных РМЖ, независимо от возраста или семейной истории, в исследованиях на европейской части РФ [6]. Ранее зарегистрирована высокая частота встречаемости мутации 5382insC в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы (до 9 %) как в Санкт-Петербурге, так и в Москве [3]. По данным, полученным в НИИ онкологии г. Томска, мутация 5382insC в гене BRCA1 также являет- ся наиболее частой из мутаций, вызывающих наследственный РМЖ. Частота носительства данной мутации достигала 16 % среди больных с наследственной отягощенностью по данному заболеванию. Данная мутация была также обнаружена в 9 % случаев раннего (до 40 лет) развития РМЖ [4].

У одной больной выявлена мутация 185delAG в гене BRCA1 (рис. 2Б). Таким образом, данные изменения обнаружены у 0,17 % пациентов с диагнозом рак молочной железы. Частота встречаемости мутантного аллеля составила 0,0008. Ранее эта мутация была зарегистрирована в исследовании наследственных форм РМЖ (ранняя форма и/или билатеральная форма/или семейная история). В НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в Санкт-Петербурге при обследовании 302 женщин был выявлен один случай носительства мутации 185delAG [17]. Первоначально данная мутация была обнаружена в популяции евреев ашкенази [18], где является преобладающей, однако в российской популяции эта мутация, по-видимому, является минорной [3]. С другой стороны, не стоит недооценивать ее вклад в риск развития РЯ [7].

В нашем исследовании мутация 4153delA в гене BRCA1 не была найдена, хотя она считается характерной для российской популяции. Эта мутация ранее была обнаружена в группах больных как РМЖ, так и РЯ [11, 13, 17]. Остальные шесть мутаций, а именно мутации 2963del10, 3819del5и 3875del4 в гене BRCA1 [3, 1], а также мутации 9318delAAAA, 1528delAAAA и S1099X в гене BRCА2 , являются минорными [1, 19]. В данном исследовании они не зарегистрированы.

Таким образом, учитывая высокую вероятность развития онкозаболеваний у носителей мутаций в генах BRCА1/2, полученные нами данные свидетельствуют о целесообразно- сти включения анализа на наличие мутаций 5382insC и 185delAG в гене BRCA1 в скрининговые программы по определению риска РМЖ в Сибирском регионе. Результатом таких программ будет увеличение выявляемости онкологических заболеваний на ранней стадии и, как следствие, увеличение продолжительности и качества жизни онкологических больных.