Анализ взаимодействия аллелей гена-рецептора витамина D при миопии

• ¹ Введение. Миопия квалифицируется как многофакторное заболевание, и если этиология со стороны анатомических особенностей строения глаза на данный момент изучена, то исследование вклада генетических факторов в предрасположенность к миопии представлено меньше.

Миопия — это особенность строения оптики глаза (аномалия рефракции), при которой лучи, преломляемые оптической системой, фокусируются перед сетчаткой.

В публикациях последних лет особое внимание уделяется роли гена-регулятора метаболизма коллагена — VDR (vitamin D receptor), продуктом которого является рецептор к витамину D. Установлено, что одной из мишеней для VDR , активированного витамином D, является ингибирование на транскрипционном уровне синтеза многих изоформ коллагена, в том числе коллагенов типа I, III и V [1], являющихся

компонентами матрикса склеры глаза, дезорганизация чего ведет к миопической рефракции. Следовательно, рецептор к витамину D, а также сам витамин D могут участвовать в развитие миопии.

Несмотря на большое число имеющихся публикаций, по-прежнему не ясно, как именно генетические системы и их взаимодействие в организме приводят к патологии структур глаза и в дальнейшем вызывают миопическую рефракцию. В связи с этим возникает необходимость исследования вклада протектив-ных и непротективных аллелей гена VDR в развитие миопии.

Ген VDR расположен на коротком плече 12-й хромосомы ( 12p12-q14 ), имеет размер около 80 Кб и содержит 9 экзонов и 8 интронов [2]. В гене выделяют некодирующую и кодирующую области. Некодирующая область находится на 5’ — конце гена и включает 1 экзон, состоящий из нескольких доменов: 1a, 1b и 1с. Последующие восемь экзонов (2–9-й) кодируют структурную часть белкового продукта гена VDR [2].

Рецептор витамина D играет роль посредника в передаче биологического действия 1,25-дигидрок- сивитамина D3 ( (la,25 (OH) 2D3) — кальцитриола), модулируя экспрессию генов на транскрипционном и посттрансляционном уровнях [3].

Для исследования ассоциации представляют интерес следующие полиморфизмы: rs1544410 (BsmI) и rs2228570 (Fok1). Полиморфный сайт гена как BsmI ( rs1544410) , находящийся в 8-м интроне, связан со стабильностью мРНК [4]. Полиморфизм представляет собой замену нуклеотида A>G в старт-кодоне, что приводит к смещению иниациаторного кодона на три кодона от начала. В результате альтернативного сплайсинга образуются несколько вариантов транскриптов, кодирующих различные белки.

Непротективный аллель *B (G) связывают с увеличением экспрессии гена, что ведет к увеличению образования продукта и, следовательно, к более активному ингибированию нормального синтеза коллагена.

Протективный аллель * b (A) характеризуется нормальным уровнем образования рецептора к витамину D, что приводит к умеренной работе последнего и не влияет на синтез изоформ коллагена.

Полиморфизм FokI располагается во 2-м экзоне гена VDR и воздействует на транскрипционные процессы. Замена T на C при трансляции старт-кодона (соответственно замена ATG — ACG) ведет к синтезу двух вариантов белка: длинному (аллель * Т или * f , также называемый формой М1, т. е. метионин в 1-й позиции) и короткому (аллель * С или * F , также называемый формой М4, т. е. метионин в 4-й позиции). Стоит отметить, что длинный белок (генотип T/T или f/f) обладает более выраженной транскрипционной активностью по сравнению с короткой.

Цель: анализ взаимодействия аллелей гена-рецептора витамина D (VDR) у пациентов с миопией для использования в ее персонифицированной ранней диагностике и профилактике.

Материал и методы. Общая выборка исследования состояла из образцов ДНК 226 человек, проживающих на территории Российской Федерации. Все обследованные студенты, а также дети и их законные представители были информированы о проводимом исследовании, получено письменное информированное согласие на участие в нем и обработку персональных данных с одобрением биоэтического комитета.

Одна группа включала больных с клинически подтвержденным диагнозом «миопия» (123 человека: 55 мужчин (45%) и 68 женщин (55%)), с разной степенью миопии и различной длиной переднезадней оси глаза (ПЗО). Высокая степень миопии характеризуется величиной клинической рефракции (дптр) более (-) 6,0 и ПЗО 25,1–27,2 мм.

Контрольная выборка состояла из 103 человек: 45 мужчин (43%) и 58 женщин (56%) с исходной эм-метропией (длина ПЗО 22,4–24,2 мм).

Молекулярно-генетическая работа выполнена в лаборатории Центра молекулярно-генетических и инновационных исследований при кафедре генетики естественно-географического факультета Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы. Клинические исследования проведены в ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России.

Для определения клинической рефракции применяли объективный способ с помощью автоматического рефракто/кератометра HRK-7000 фирмы Huvitz. Переднезаднюю длину оси глаза определяли с помощью оптического биометра IOL–Master 500 (Carl Zeiss, Германия). Для определения кандидат-ных генов при генетико-эпидемиологических исследованиях использовалась программа SNPStats, которая находится в открытом доступе по ссылке: [5].

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса использовали методику выделения ДНК из крови, разработанную К. Мэтью [6]. Праймеры (табл. 1) подобраны из базы данных GenBank . Генотипирование проводили по методу KASPTM (Kompetitive Allele Specific PCR) на анализаторе серии BIO-RADCFX Real-time, PCR. Межгенное взаимодействие определяли по программе Multifactor Dimensionality Reduction 2.0 (MDR 2.0).

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакета программ Statistica for Windows 6.0 (StatSoft), программного обеспечения MS Excel 2013 (Microsoft). Для выявления ассоциации между генотипами и клиническими значениями статистическая обработка данных проведена с использованием таблиц сопряженности 2х2 (с поправкой Йейтса на непрерывность). Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди — Вайнберга использовали модифицированный критерий c2 (Р). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в двух различных группах использовался двусторонний критерий Фишера p (F2). Достоверными считали различия частот аллелей и генотипов при значении р≤0,05. Для всех исследованных полиморфных вариантов, как в контрольной, так и в опытной выборке, распределение частот генотипов данных локусов соответствует равновесию Харди — Вайнберга (p<0,05).

Результаты. Анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs1544410 гена VDR показал, что протективный ал-

Таблица 1

Тип полиморфизма и последовательность праймеров

Тип полиморфизма, локализация	Праймеры (рестриктаза)	Ссылка
VDR rs2228570 (Fok1, Ex4+4T>C) 12p12-q14, 2-й экзон	Прямой: 5’AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3’ Обратный: 5’ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’ Рестриктаза: Fok1 (инкубация при 37°С)	[1]
VDR rs1544410 (BsmI), A>G 12p12-q14, 8-й интрон	Прямой: 5’ — GCATCGTCTCCCCAGGTATG-3’ Обратный: 5’ — ACCAGCGGAAGAGGTCAAG-3’ Рестриктаза: PctI (инкубация при 37°С)	[4]

Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs1544410 гена VDR

Генотип/аллель	Контроль (n=103)		Миопы (n=123)		p (x2)
	n	pi+si	n	pi+si
B/B	18	0,17±0,03	43	0,35±0,04	0,004 (7,83) *
B/b	47	0,46±0,05	38	0,31±0,04	0,023 (5,4) *
b/b	38	0,37±0,05	42	0,34±0,04	0,772 (0,085)
*B	83	0,40±0,03	124	0,50±0,03	0,04 (4,22) *
*b	123	0,60±0,03	122	0,50±0,03	0,04 (4,22) *

Примечание: * — р<0,01.

лель *b достоверно чаще встречается в группе здоровых индивидов (р=0,04, х²=4,22). Так, частота аллеля *b в группе здоровых людей составляет 60%, при 50% в группе с миопией. Гетерозиготный генотип B/b встречается в группе контроля с частотой 46%, а в группе миопов с частотой 31 %, что связано с про-тективной функцией аллеля *b , который характеризуется нормальным уровнем образования рецептора к витамину D, что приводит к умеренной работе последнего и не снижает синтез изоформ коллагена склеральной ткани глаза (табл. 2).

В группе с миопией достоверно выше частота мутантного аллеля *В и гомозиготного по мутантному аллелю генотипа B/B (р=0,04, х²=4,22 и р=0,006, х²=7,83 соответственно). Частота аллеля *B в группе с миопией составляет 50%, что выше, чем в группе контроля: 40%. Мутантный гомозиготный генотип B/B встречается в группе миопов с частотой 35%, что значительно выше, чем в группе контроля: 17%. Это связано с более активной экспрессией гена, что ведет к увеличению образования белкового продукта и, следовательно, к более активному ингибированию нормального синтеза коллагена склеры. Анализ взаимодействия аллелей полиморфного варианта rs1544410 гена VDR с помощью программы SNPstats выявил рецессивный тип их взаимодействия (р=0,0018), AIC=305,8 (табл. 3).

Учитывая, что наиболее подходящая модель выбирается согласно наименьшему критерию Акаике (AIC), в данном случае достоверной моделью взаимодействия считается рецессивная. Такая модель свидетельствует о том, что для проявления заболевания требуются оба варианта непротективных алле- лей, т.е. гомозигота — B/B, а гетерозиготные особи B/b защищены при наличии рецессивного аллеля.

Результаты анализа распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs2228570 гена VDR в группе с миопией и группе контроля с помощью таблицы сопряженности 2х² с поправкой Йейтса на непрерывность представлены в табл. 4.

Анализ распределения частот генотипов и аллелей показал достоверные значения по протективно-му генотипу Т/Т (р=0,055, х²=3,67). В группе контроля данный генотип встречается с частотой 39%, а группе больных наблюдается у 26% индивидов. Протектив-ный аллель *Т достоверно чаще встречается в контроле: у 67%, а среди миопов у 53% (р=0,0031, х²=9,з6).

В группе с миопией достоверно выше частота мутантного аллеля *С и гомозиготного по мутантному аллелю генотипа С/С (р=0,0031, х²=9,36 и р=0,001, х²=12,118 соответственно). Частота аллеля *С в группе с миопией составляет 47%, что выше, чем в группе контроля: 33%. Мутантный гомозиготный генотип С/С встречается в группе миопов с частотой 20%, что значительно выше, чем в группе контроля: 4%, из чего следует, что транскрипционно менее активный короткий вариант *С связан с подавлением нормального синтеза изоформ коллагена, что не способствует нормальному формированию склеральной ткани.

Результаты SNP-анализа полиморфного варианта rs2228570 гена VDR, проведенного с помощью программы SNPstas, представлены в табл. 5.

SNP-анализ полиморфного варианта rs2228570 гена VDR выявил три достоверные модели взаимодействия: кодоминантную (р=0,0001, AIC=301,1, ОШ=1,40, ДИ=0,78–2,50), рецессивную (р=0,0001,

Таблица 3

SNP-анализ полиморфного варианта rs1544410 гена VDR

Модель	Генотип	Контроль	Миопы	ОШ (95% ДИ)	р	AIC
Кодоминантная	b/b B/b B/B	38 (36,9%) 47 (45,6%) 18 (17,5%)	42 (34,1%) 37 (30,1%) 44 (35,8%)	1,00 0,71 (0,39–1,32) 2,21 (1,10–4,46)	0,004	306,7*
Доминантная	b/b B/b — B/B	38 (36,9%) 65 (63,1%)	42 (34,1%) 81 (65,8%)	1,00 1,13 (0,65–1,95)	0,67	315,3
Рецессивная	b/b — B/b B/B	85 (82,5%) 18 (17,5%)	79 (64,2%) 44 (35,8%)	1,00 2,63 (1,40–4,93)	0,001	305,8*
Сверхдоминантная	b/b — B/B B/b	56 (54,4%) 47 (45,6%)	86 (69,9%) 37 (30,1%)	1,00 0,51 (0,30–0,89)	0,016	309,7
Лог-аддитивная	- —	- —	- —	1,41 (1,00–1,97)	0,045	311,5

П римечание : * — р<0,01.

Таблица 4

Генотип/аллель	Контроль (n=103)		Миопы (n=123)		p (x2)
	n	pi+si	n	pi+si
C/C	4	0,04±0,02	25	0,20±0,03	0,001 (12,118) *
C/T	59	0,57±0,05	66	0,54±0,04	0,680 (0,17)
T/T	40	0,39±0,05	32	0,26±0,04	0,055 (3,67) *
*C	67	0,33±0,03	116	0,47±0,03	0,003 (9,36) *
*T	139	0,67±0,03	130	0,53±0,03	0,003 (9,36) *

Примечание: * — р<0,01.

Таблица 5

Модель	Генотип	Контроль	Миопы	ОШ (95% ДИ)	р	AIC
Кодоминантная	T/T С/Т C/C	40 (38,8%) 59 (57,3%) 4 (3,9%)	32 (26,0%) 66 (53,7%) 25 (20,3%)	1,00 1,40 (0,78–2,50) 3,92 (1,21–12,75)	0,0001	301,1*
Доминантная	T/T С/Т — C/C	40 (38,8%) 63 (61,2%)	32 (26,0%) 91 (74%)	1,00 1,81 (1,03–3,18)	0,04	311,3
Рецессивная	T/T — С/Т С/С	99 (96,1%) 4 (3,9%)	98 (79,7%) 25 (20,3%)	1,00 6,31 (2,12–18,81)	0,0001	300,4*
Сверхдоминантная	Т/Т- C/C С/Т	44 (42,7%) 59 (57,3%)	57 (46,3%) 66 (53,7%)	1,00 0,86 (0,51–1,46)	0,59	315,2
Лог-аддитивная	-	-	-	2,11 (1,36–3,26)	0,0001	303,6*

П ри мечан ие : * — р<0,01.

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs2228570 гена VDR

SNP-анализ полиморфного варианта rs2228570 гена VDR

AIC=300,4, ОШ=6,31, ДИ=2,12–18,81) и лог-аддитивную (р=0,0001, AIC=303,6, ОШ=2,11, ДИ=1,36–3,26), каждая из которых свидетельствует о рисковом влиянии мутантного генотипа C/C и аллеля *C на развитие миопии.

Кодоминантная модель взаимодействия указывает на то, что каждый генотип изменяет риск развития миопии, независимо от остальных, неаддитивно [5], а значит, наличие даже одного мутантного аллеля *С является рисковым для развития миопии.

Учитывая, что наиболее подходящая модель выбирается согласно наименьшему критерию Акаике (AIC), в данном случае достоверной моделью взаимодействия считается рецессивная. Такая модель свидетельствует о том, что для проявления заболевания требуются оба варианта непротективных аллелей, т. е. гомозигота — С/С.

Проанализировано 9 из девяти возможных сочетаний попарного сравнения гаплотипов аллелей гена VDR (rs1544410, BsmI) и VDR (rs2228570, Fok1) в группе с миопией и в группе контроля. Гаплотипный анализ распределения частот сочетаний аллелей гена VDR по полиморфным вариантам (rs1544410, BsmI) и VDR (rs2228570, Fok1) выявил достоверное различие в исследуемых группах по сочетанию про-тективных генотипов b/b и T/T В группе контроля такое сочетание имеют 47% индивидов, а в группе с миопией 24% (р=0,03, х²=4,51; табл. 6).

Таблица 6

Контроль (n=103)				Миопы (n=123)				р (х2)
VDR (BsmI)	VDR (Fok1)	n	pi	VDR (BsmI)	VDR (Fok1)	n	pi
b/b	T/T	18	0,47	b/b	T/T	10	0,24	0,03 (4,51) *
b/b	C/T	17	0,45	b/b	C /T	21	0,51	0,91 (0,013)
b/b	C/C	3	0,08	b/b	C/C	10	0,25	0,09 (2,81)

Окончание табл 6.

	Контроль (n=103)			Миопы (n=123)				р (х2)
VDR (BsmI)	VDR (Fok1)	n	pi	VDR (BsmI)	VDR (Fok1)	n	pi
B/b	T/T	17	0,36	B/b	T/T	9	0,24	0,03 (4,65) *
B/b	C/T	30	0,64	B/b	C/T	20	0,54	0,03 (4,69) *
B/b	C/C	1	0,04	B/b	C/C	9	0,22	0,06 (7,85) *
B/B	T/T	5	0,28	B/B	T/T	13	0,3	0,13 (2,49)
B/B	C/T	12	0,66	B/B	C/T	25	0,57	0,008 (3,08) *
B/B	C/C	1	0,06	B/B	C/C	6	0,13	0,09 (2,85) *

П римечание : * — р<0,05.

Распределение частот сочетаний генотипов полиморфных вариантов гена VDR (rs1544410, BsmI) и VDR (rs2228570, Fok1)

Выявлено протективное влияние рецессивных аллелей и в гаплотипах B/b и T/T (р=0,03, х²=4,65), B/b и C/T (р=0,03, х²=4,69), B/b и C/C (р=0,06, х²=7,85). Мутантные аллели гена VDR связаны с более активной экспрессией гена, что ведет к увеличению образования продукта и, следовательно, к более активному ингибированию нормального синтеза коллагена склеры, что увеличивает риск нарушений в ее строении и ведет к развитию миопии. Гаплотипы B/B (rs1544410, BsmI) C/C (rs2228570) в гене VDR характеризуют предрасположенность к развитию осложненной миопии. Так, у этих пациентов наблюдаются высокая величина клинической рефракции и высокие характеристики переднезадней оси глаза.

Обсуждение. Известно, что рецептор к витамину D ( VDR ) относится к ядерным рецепторам надсемейства транскрипционных факторов, лигандами для которых являются стероидные гормоны. Данная группа рецепторов включает в себя рецепторы к эстрогенам, прогестерону, андрогенам, глюкокортикоидным и минералокортикоидным гормонам. Основным лигандом для VDR является витамин 1,25 (OH) 2D3 [7]. Рецептор витамина D играет роль посредника в передаче биологического действия 1,25-дигидроксивитамина D3 (la,25 (OH) 2D3) — кальцитриола, модулируя экспрессию генов на транскрипционном и посттрансляционном уровнях [3].

Рецепторы к витамину D (РВД) обнаружены в клетках более тридцати тканей организма человека, в том числе в фоторецепторах, ганглиозных клетках и клетках пигментного эпителия сетчатки, эпителия ресничного тела и хрусталика, а также в эндотелии и базальном эпителии роговицы [8].

Функции VDR в тканях глаза человека до сих пор не изучены. Однако было установлено, что одной из мишеней для VDR , активированного витамином D, является ингибирование на транскрипционном уровне синтеза многих изоформ коллагена, в том числе коллагенов типа I, III и V, являющихся компонентами матрикса склеры [1]. Для исследования в области миопии представляет интерес такой полиморфный сайт гена, как BsmI ( rs1544410) , нахо-дящийсяв 8-м интроне, который связан со стабильностью мРНК [4].

Возможной функцией рецептора к витамину D (ген VDR ) в тканях глаза может быть регуляция экспрессии генов коллагенов. Следовательно, рецептор к витамину D, а также сам витамин D могут иметь значение в регуляции роста глаза и, соответственно, в развитии миопии.

Мутации же, приводящие к замене любой аминокислоты, исключают возможность связывания рецептора к витамину D (ген VDR) со специфической по- следовательностью ДНК, прерывая РВД-зависимую активацию генов-мишеней.

РВД, как и другие ядерные рецепторы, регулирует транскрипцию генов путем связывания с их специфическими последовательностями в области промоторов. Такие последовательности были названы элементами ответа витамина (ЭОВД). В настоящее время обнаружено ограниченное количество генов, находящихся под контролем кальцитриола. ЭОВД представляет собой прямой повтор гексануклеотидной последовательности G/AGGTG/CA с трёхнуклеотидной областью спейсера, отделяющего две части элемента. Одним из генов, содержащих ЭОВД, является ген СOL1A1 , и установлено, что одной из мишеней для VDR , активированного витамином D, является ингибирование на транскрипционном уровне синтеза многих изоформ коллагена, в том числе коллагенов типа I, III и V, являющихся компонентами матрикса склеры, нарушение структуры которой ведет к миопии [4].

Следовательно, рецептор к витамину D, а также сам витамин D могут играть роль в патогенезе миопии, так как ведущим фактором в патогенезе миопии является растяжение склеры вследствие ослабления ее прочностных свойств из-за ингибирования синтеза изоформ коллагена. В нашем исследовании показана достоверно высокая частота распределения непротективных аллелей и генотипов по гену VDR в группе с клинически диагностированной миопией в сравнении с контрольной группой.

Поэтому дальнейшие исследования необходимо направить на изучение аллелей генов, кодирующих коллагены разных типов, особенно коллаген 1-го тип (ген COL1A1 ), который является определяющим в предрасположенности к миопии. Дальнейшие исследования взаимного влияния аллелей генов, кодирующих коллагены, и усвоения витамина D необходимы для выявления их взаимодействия как для предикции развития миопии, так и для профилактики заболевания до его манифестации. Это уникальная возможность для раскрытия и понимания данной аномалии рефракции.

Заключение. Выявлена взаимосвязь степени тяжести миопии у пациентов с полиморфизмами гена VDR . Анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs1544410 гена VDR показал, что протективный аллель * b (A) чаще встречается в группе здоровых индивидов, который характеризуется нормальным уровнем образования рецептора к витамину D, что приводит к умеренной работе последнего и не снижает синтез изоформ коллагена склеральной ткани глаза.

Другой полиморфизм VDR (rs2228570, Fok1) представляет собой замену нуклеотида по типу тран- зиции (A>G) в старт-кодоне, что приводит к смещению иниациаторного кодона на три кодона от начала. В результате альтернативного сплайсинга образуются несколько вариантов транскриптов, кодирующих различные белки. Непротективный аллель*B (G) связывают с увеличением экспрессии гена, что ведет к увеличению образования продукта и, следовательно, к более активному ингибированию нормального синтеза коллагена.

Выявлено повышение частоты гомозиготного генотипа C/C и непротективного аллеля *С полиморфного варианта rs2228570 гена VDR в группе с миопией, поскольку данный аллель подавляет РВД-зависимую активацию генов-мишеней нормального синтеза изоформ коллагена и сдерживает нормальное формирование склеральной ткани из-за нестабильности мРНК. Следовательно, происходит более активное ингибирование нормального формирования склеральной ткани. Выполненное исследование демонстрирует, что пациенты, наследующие этот аллель, составляют группу с высокой миопией.

Гаплотипный анализ выявил протективные сочетания аллелей b/b (rs1544410, BsmI) и T/T (rs2228570, Fok1), B/b (rs1544410, BsmI) и T/T (rs2228570, Fok1), B/b (rs1544410, BsmI) и C/T (rs2228570, Fok1) гена VDR , которые обеспечивают нормальный синтез коллагена склеры (p=0,03, х² =4,51).

Выявлены гаплотипы B/B (rs1544410, BsmI) C/C (rs2228570) и B/b (rs1544410, BsmI) C/C (rs2228570) в гене VDR , которые характеризуют предрасположенность к развитию осложненной миопии.

Таким образом, показано, что сочетания непро-тективных аллелей и генотипов по полиморфным вариантам в гене VDR могут быть использованы как диагностические маркеры выявления предрасположенности к миопии, поскольку продукты мутантных аллелей вызывают нарушения в структурах «каркаса» глазного аппарата, что ведет к миопической рефракции из-за подавления нормального синтеза изоформ коллагена и не способствует нормальному формированию склеральной ткани.