Анализ засухоустойчивости различающихся по стратегии адаптации к засухе растений пшеницы Triticum aestivum L. на начальном этапе онтогенеза

Исследование устойчивости к неблагоприятным факторам среды, вызывающим нарушение водного режима, — одна из центральных проблем современных наук о растениях. Как известно, засуха относится к наиболее распространенным стрессам, приводящим к нарушению всех звеньев метаболизма и существенной потере урожая у культурных растений, в том числе у пшеницы (1-3). Наиболее критичная фаза в развитии пшеницы — ранний этап онтогенеза. В этот период растения особенно чувствительны к действию неблагоприятных факторов и дефицит влаги вызывает снижение всхожести семян, ингибирование их прорастания и роста всходов, а также отставание культуры в развитии, что, в свою очередь, приводит к значительному снижению продуктивности (4, 5). В связи с этим особый интерес представляет исследование механизмов формирования засухоустойчивости на раннем этапе развития растений с целью выявления наиболее эффективных компонентов защиты при нарушении водного режима и управления ими (5-7).

В процессе естественного и искусственного отбора в зависимости от вида засухи сформировались две существенно различающиеся по стратегии адаптации группы пшеницы — лесостепной западносибирский и степной волжский экотипы (8-10). Растения западносибирского экотипа отличаются замедленной всхожестью и довольно длительной фазой кущения из-за характерной для регионов Западной Сибири весенней засухи. Обильные летние дожди, типичные для западносибирского климатического пояса, используются растениями этого экотипа для быстрого роста и развития. Для сортов степного волжского экотипа характерен интенсивный рост в начале вегетации, для чего используются весенние запасы влаги в почве, поэтому к моменту наступления летней засухи растения образуют разветвленную сеть корней, что способствует формированию хорошего урожая. То есть различия в адаптации к засухе у сортов пшеницы лесостепного западносибирского и степного волжского экотипов особенно ярко проявляются на ранней стадии развития растений. Поэтому представляет интерес изучение особенностей защитных механизмов таких экотипов при дефиците влаги на начальном этапе онтогенеза, что позволит продвинуться в понимании механизмов формирования у них засухоустойчивости.

В настоящей работе впервые выявлены индуцированные засухой изменения в гормональном балансе и содержании аминокислоты пролина у лесостепного западносибирского и степного волжского экотипов пшеницы на начальном этапе онтогенеза. Проростки степного волжского экотипа проявили более выраженную устойчивость к обезвоживанию в сравнении с растениями лесостепного западносибирского экотипа, что обусловлено существенно меньшими по амплитуде стресс-индуцированными перестройками в содержании фитогормонов и более высоким накоплением пролина.

Цель работы состояла в оценке физиолого-биохимических показателей растений пшеницы сортов Зауральская Жемчужина (лесостепной западносибирский экотип) и Экада 70 (степной волжский экотип) в начальную фазу их онтогенеза в норме и в условиях засухи.

Методика. В качестве объектов исследования использовали растения мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) степного волжского (сорт Экада 70) и лесостепного западносибирского (сорт Зауральская Жемчужина) экотипов, предоставленные Чишминским селекционным центром Башкирского НИИ сельского хозяйства (Республика Башкортостан, р.п. Чишмы). Семена предварительно стерилизовали 96 % этанолом и использовали в двух сериях опытов.

В первой серии семена раскладывали по 15 шт. в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 5 мл растворов концентрированной сахарозы (4 %, 8 % и 12 %), моделирующих засуху (11, 12). После этого чашки Петри помещали в термостат ТСО-1/80 СПУ (ОАО «Смоленское специальное конструкторско-технологическое бюро систем программного управления», Россия) и проращивали семена в темноте при 22 ° С в течение 3 сут. В качестве контроля использовали семена, пророщенные на дистиллированной воде. На 3-и сут рассчитывали энергию прорастания, которую определяли по соотношению (%) числа проросших семян к общему числу заложенных на проращивание. Проросшими считали семена, давшие корешок минимальной длины. У проросших семян измеряли длину главного корня (13).

Во второй серии проводили вегетационные опыты в контролируемых условиях. Семена высевали в вегетационные сосуды (25½25½25 см) объемом 15 л (по 30 растений на емкость, глубина посева — 4-5 см, расстояние между рядками — 2,5 см, расстояние между растениями в ряду — 2,5 см). В каждый вегетационный сосуд на дно помещали керамзит агротехнический (слой 2-3 см) (ООО «Терра Мастер», г. Красноярск). Сверху керамзита засыпали почвогрунт с оптимальным соотношением NPK (pH 6,5, влажность 65 %; ООО «Велторф», Россия). Растения выращивали в контролируемых условиях (температура 21-23 ° С, 16-часовой фотопериод, освещенность 360 мкмоль^м ²•с ' , влажность воздуха 60 %). Часть растений подвергали ранней почвенной засухе: при ее моделировании полив не проводили до достижения значения 30 % влажности от полной влагоемкости почвы (ПВП). В контроле поддерживали влажность 70 % от ПВП.

Физиолого-биохимические показатели оценивали на этапе всходов (возраст проростков 7-9 сут). Использовали периодизацию онтогенеза хлебных злаков в разработке Т.Б. Батыгиной (14). На 7-е, 8-е и 9-е сут измеряли сырую и сухую массу контрольных и подверженных действию почвенной засухи проростков. Эксперименты по оценке показателей роста проводили в трех биологических повторах, каждый вариант включал не менее 30 растений.

Содержание цитокининов (ЦК), индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой (АБК) кислоты в 10 проростках пшеницы (сырая масса 0,9-1,0 г) на 7-е, 8-е и 9-е сут определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специфичных кроличьих антител и меченных пероксидазой антикроличьих антител (15). Проростки гомогенизировали в 80 % этаноле в соотношении масса: объем 1:10 с последующим инкубированием образцов при 4 ° С в течение 16 ч. После центрифугирования при 10000 g в течение 20 мин (центрифуга Avanti J-E, «Beckman Coulter, Inc.», США) супернатант упаривали в токе воздуха до водного остатка, в аликвоте которого определяли суммарное содержание свободных цитокининов. Из оставшегося водного остатка ИУК и АБК экстрагировали серным эфиром, метилировали их диазометаном, после упаривания сухой остаток растворяли в 80 % этаноле, в аликвоте определяли количество ИУК и АБК. Процедура очистки и извлечения ИУК и АБК, а также последовательность этапов иммуноанализа фитогормонов описаны ранее (15).

Экстракцию и определение свободного пролина проводили согласно L.S. Bates с соавт. (16). Образцы растительного материала (2 г) заливали кипящей дистиллированной водой (2,5 мл) и охлаждали. К 2 мл холодной пробы приливали 2 мл нингидринового реактива и 2 мл ледяной уксусной кислоты, смесь кипятили в течение 1 ч и охлаждали. Интенсивность окрашивания комплекса пролина с нингидрином определяли при λ = 522 нм. Содержание пролина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, для построения которой использовали химически чистый пролин («Sigma Aldrich», США).

На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические значения ( M ) по трем независимым опытам, каждый из которых проведен в трех биологических повторностях, и их стандартные ошибки (±SEM). Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью дисперсионного анализа ANOVA, используя SPSS 13.0 для Windows («SPSS, Inc.», США). Достоверность различии между средними оценивали с помощью LSD-теста при p ≤ 0,05.

Результаты. Засуха как один из наиболее распространенных в природе неблагоприятных абиотических факторов среды существенно снижает показатели функциональной активности клеток у растений пшеницы, особенно на ранних этапах развития (17-19). В этот период семена и молодые проростки наиболее чувствительны к нарушению водного режима.

В процессе естественного и искусственного отбора на территории России сформировались две существенно различающихся по стратегии адаптации к засухе экологические группы пшеницы — лесостепной западносибирский и степной волжский экотипы. Для регионов Западной Сибири характерна весенняя засуха, в связи с чем растения пшеницы лесостепного западносибирского экотипа отличаются замедленным ростом на начальном этапе онтогенеза. В юго-восточных районах европейской части России, в частности в Поволжье, засуха наблюдается позднее, и сорта степного волжского экотипа интенсивно растут в начале вегетации, чтобы максимально развить разветвленную сеть корней.

1. Энергия прорастания (%) семян пшеницы Triticum aestivum L. яровых сортов Экада 70 (степной волжский экотип) и Зауральская Жемчужина (лесостепной западносибирский экотип) на растворах сахарозы разной концентрации ( M ±SEM, лабораторный опыт)

Сорт	Контроль	Раствор сахарозы, %
		4	8	12
Экада 70	91,1±3,9Aa	80,2±3,4Ab	71,1±3,1Ac	40,7±1,7Ad
Зауральская Жемчужина	85,3±3,7Aa	72,4±3,2Bb	60,8±2,7Bc	20,5±0,9Bd
Пр и м еч ани е. Проведены три опыта в трех повторностях			по 15 семян в каждой. Разными буквами
обозначены статистически значимые различия между вариантами при p ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест). Боль-
шими буквами обозначены различия в столбцах,		маленькими —	в строках.

2. Длина главного корня (см) у 3-суточных проростков пшеницы Triticum aes-tivum L. яровых сортов Экада 70 (степной волжский экотип) и Зауральская Жемчужина (лесостепной западносибирский экотип) на растворах сахарозы разной концентрации ( M ±SEM, лабораторный опыт)

Сорт	Контроль	Раствор сахарозы, %
		4	□        8        1	12
Экада 70	2,95±0,13Aa	1,91±0,08Ab	0,86±0,04Ac	0,23±0,01Ad
Зауральская Жемчужина	2,44±0,11Ba	1,26±0,06Bb	0,49±0,02Bc	0,05±0,002Bd

Пр и м еч ани е. Проведены три опыта в трех повторностях (от 25 до 125 проростков в варианте). Разными буквами обозначены статистически значимые различия между вариантами при p ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест). Большими буквами обозначены различия в столбцах, маленькими — в строках.

В первой серии наших экспериментов засухоустойчивость растений оценивалась по энергии прорастания семян (табл. 1) и длине главного корня 3-суточных проростков (табл. 2) в растворах сахарозы разной концентрации (4, 8 и 12 %), моделирующих засуху. Было установлено, что имитирующие засуху растворы сахарозы подавляли прорастание семян обоих экотипов пшеницы, причем энергия прорастания снижалась с увеличением концентрации сахарозы.

В работах других авторов показано, что на начальных этапах онтогенеза воздействие обезвоживания приводит к торможению прорастания семян и роста всходов, что в дальнейшем существенно снижает урожай пшеницы (20, 21). Необходимо отметить, что процент проросших семян свидетельствует о способности растений определенного сорта использовать труднодоступную влагу и указывает на его относительную засухоустойчивость. Так, семена сорта Экада 70 характеризовались более высоким показателем энергии прорастания на концентрированных растворах сахарозы в сравнении с семенами сорта Зауральская Жемчужина (см. табл. 1). Эти результаты подтверждают приведенные ранее данные о более высокой засухоустойчивости пшеницы степного волжского экотипа на ранних этапах онтогенеза (22).

В то же время в условиях обезвоживания происходило ингибирование роста главного корня у 3-суточных проростков пшеницы обоих экотипов (см. табл. 2). Однако на растворах сахарозы у растений сорта Экада 70 — представителя степного волжского экотипа рост главного корня тормозился существенно меньше, чем у проростков сорта Зауральская Жемчужина.

Время после прорастания, сут

Рис. 1. Сырая (А) и сухая (Б) масса 7-9-суточных проростков пшеницы Triticum aestivum L. яровых сортов Экада 70 (слева) и Зауральская Жемчужина (справа) в условиях моделируемой почвенной засухи: 1 — контроль, 2 — опыт ( M ±SEM, вегетационный опыт). Проведены три опыта в трех повторностях, в каждой по 30 проростков. Разными строчными буквами обозначены статистически значимые различия между вариантами опыта в одно и то же время при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест). Разными прописными буквами обозначены статистически значимые различия между показателями в варианте опыта для проростков разного возраста при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест).

В лабораторных экспериментах можно получить представление лишь о потенциальной засухоустойчивости растений. Вместе с тем практическое значение имеют данные о поведении сортов в полевых или приближенных к ним условиях. В связи с этим мы изучили воздействие почвенной засухи, которую моделировали отсутствием полива, на ростовые процессы у проростков разных экотипов пшеницы в вегетационном опыте. Установлено, что растения сорта Экада 70 в контроле характеризовались повышенной массой проростков на протяжении всего опыта относительно менее устойчивого к засухе сорта западносибирской селекции (рис. 1).

Условия почвенной засухи привели к заметному торможению показателей роста у проростков обоих сортов, но у сорта Зауральская Жемчужина оно было более выражено (см. рис. 1). Можно констатировать, что разные по стратегии адаптации к засухе экотипы пшеницы различаются по устойчивости к дефициту влаги на начальном этапе развития: растения степного волжского экотипа более засухоустойчивы в сравнении с представителями лесостепного западносибирского экотипа. Изменения, которые мы наблюдали у исследуемых экотипов, обусловлены генетическими и эколого-физиологическими факторами (9, 10).

Рис. 2. Содержание абсцизовой (А), индолилуксусной кислоты (Б) и цитокининов (В) у 7-9-суточных проростков пшеницы Triticum aestivum L. яровых сортов Экада 70 (слева) и Зауральская Жемчужина (справа) в условиях моделируемой почвенной засухи: 1 — контроль, 2 — опыт (M±SEM, вегетационный опыт). Проведены три опыта в трех повторностях, в каждой по 10 проростков. Разными строчными буквами обозначены статистически значимые различия между вариантами опыта для проростков одного и того же возраста при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест). Разными прописными буквами обозначены статистически значимые различия между показателями в варианте опыта для проростков разного возраста при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест).

Ключевая роль в регуляции роста и развития растений отводится гормональной системе (23-25), в связи с чем важно было проследить изменения в ее состоянии у сравниваемых сортов пшеницы в условиях почвенной засухи (рис. 2). Согласно полученным результатам, контрольные растения устойчивого сорта Экада 70 характеризовались заметно большим содержанием ауксина и цитокининов по сравнению с сортом Зауральская Жемчужина, при этом концентрация АБК у обоих сортов оказалась практически одинаковой. Ранее во многих исследованиях был выявлен ярко выраженный ростостимулирующий эффект ИУК и ЦК (15, 17), вероятно, поэтому у растений сорта Экада 70 параметры, описывающие скорость роста, были выше в сравнении с проростками сорта Зауральская Жемчужина (см. рис. 1). Вместе с тем хорошо известно, что в неблагоприятных условиях, в частности при нарушении водного режима, происходят существенные перестройки в гормональном балансе растений, характеризующиеся резким повышением концентрации гормона стресса — абсцизовой кислоты и снижением количества ростостимулирующих гормонов ауксинов и цитокининов (17, 23, 26).

Действительно, можно видеть (см. рис. 2), что выращивание пшеницы в условиях моделируемой почвенной засухи также привело к изменениям в гормональном статусе проростков у обоих изученных сортов. Происходило накопление АБК и заметное снижение концентрации ИУК и ЦК, однако исследуемые сорта различались по этим показателям.

Так, у засухоустойчивого сорта Экада 70 максимальное 2-кратное накопление АБК в проростках наблюдалось только на 7-е сут, после чего количество АБК постепенно снижалось. У сорта Зауральская Жемчужина более чем 2-кратное стресс-индуцированное накопление АБК в проростках поддерживалось до конца опыта. Воздействие почвенной засухи привело к поступательному уменьшению концентрации ИУК и цитокининов в проростках у обоих сортов, но в растениях сорта Зауральская Жемчужина к концу опыта (9-е сут) содержание ИУК и цитокининов оказалось почти в 2,5 раза ниже контрольных значений (см. рис. 2). То есть при нарушении водного режима в растениях сорта Зауральская Жемчужина наблюдался резкий дисбаланс фитогормонов, что привело к выраженному торможению роста. В то же время растения сорта Экада 70 проявили устойчивость к дефициту влаги, что было обусловлено существенно меньшими по амплитуде стресс-индуцированными перестройками в состоянии гормональной системы.

В связи с тем, что дефицит влаги вызывает не только нарушение водного режима, но и осмотический стресс, мы проанализировали изменение количества аминокислоты пролина как одного из эффективных осмопротекторов в проростках пшеницы двух сортов (рис. 3). Контрольные варианты характеризовались относительно стабильным содержанием пролина на протяжении всего опыта, хотя корни растений сорта Зауральская Жемчужина отличались несколько меньшей величиной этого показателя (см. рис. 3). У обоих сортов в проростках при почвенной засухе наблюдалось существенное поступательное накопление пролина в сравнении с контролем (см. рис. 3), что указывает на участие этой аминокислоты в защите растений от обезвоживания. Так, у сорта Экада 70 в стрессированных проростках к 9-м сут опыта содержание пролина возросло более чем втрое по сравнению с контрольными значениями. У сорта Зауральская Жемчужина также наблюдалось стресс-индуцированное накопление пролина в проростках в течение опыта, но абсолютные значения этого показателя уступали таковым у сорта Экада 70 (см. рис. 3).

Рис. 3. Содержание пролина у 7-9-суточных проростков пшеницы Triticum aestivum L. яровых сортов Экада 70 (слева) и Зауральская Жемчужина (справа) в условиях моделируемой почвенной засухи: 1 — контроль, 2 — опыт ( M ±SEM, вегетационный опыт). Проведены три опыта в трех повторностях, в каждой по 20 проростков. Разными строчными буквами обозначены статистически значимые различия между вариантами опыта для проростков одного и того же возраста при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест). Разными прописными буквами обозначены статистически значимые различия между показателями в варианте опыта для проростков разного возраста при р ≤ 0,05 (ANOVA, LSD-тест).

Как известно, засуха вызывает снижение осмотического потенциала растений, чем индуцируется накопление одного из ключевых осмолитов — пролина (27, 28). Во многих работах было показано, что увеличение содержания пролина сопровождалось повышением стресс-устойчивости растений (29, 30). Более того, накопление пролина способствует снижению содержания активных форм кислорода и значительно уменьшает повреждение мембран, вызванное воздействием неблагоприятных факторов, в том числе засухи (31). Наблюдается положительная корреляция между повышенным уровнем пролина и устойчивостью растений к экстремальным условиям. Мы установили, что в норме у устойчивого к засухе сорта Экада 70 в проростках содержалось в среднем на 25-30 % больше этого осмопротектора, чем у сорта Зауральская Жемчужина (см. рис. 3). В условиях моделируемой почвенной засухи у обоих сортов происходило поступательное накопление пролина в проростках, хотя у засухоустойчивого сорта Экада 70 оно во все сроки наблюдения было более чем в 1,5 раза выше, чем у сорта Зауральская Жемчужина, что, вероятно, способствует проявлению большей устойчивости степного волжского экотипа к засухе на начальном этапе онтогенеза.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о различии в устойчивости к дефициту влаги у сортов Зауральская Жемчужина (лесостепной западносибирский экотип) и Экада 70 (степной волжский экотип) на начальном этапе развития растений. В условиях засухи у сорта Экада 70 энергия прорастания семян и показатели роста проростков были выше, то есть этот сорт проявлял большую засухоустойчивость в сравнении с сортом Зауральская Жемчужина. Различия в засухоустойчивости экотипов могут быть обусловлены неодинаковой реакцией гормональной системы на дефицит влаги. Растения сорта Зауральская Жемчужина характеризовались гораздо большими по амплитуде стресс-индуцированными изменениями в гормональном балансе, что привело к более выраженному торможению их роста. Значительный вклад в формирование лучшей засухоустойчивости 138

сорта Экада 70 вносит его способность индуцировать существенное накопление аминокислоты пролина — важного компонента защитной системы растений.