Антибактериальная активность экстрактов из цветков космеи дваждыперистой (Cosmos bipinnatus cav.) в отношении некоторых клинических изолятов

Распространение устойчивости к антибиотикам среди микроорганизмов и ограниченность арсенала лекарственных средств для лечения различных видов инфекций – важная проблема общественного здравоохранения. Одним из путей, позволяющих решить данную проблему, является поиск и разработка новых противомикробных субстанций различного происхождения с новыми механизмами действия.

В настоящее время огромный интерес вызывает растительное сырье. Растительные лекарственные объекты все чаще оказываются перспективными источниками для производства лекарственных средств, благодаря меньшим побочным эффектам по сравнению с синтетическими веществами [Сибирцев, Нечи-поренко, 2021]. Стоит отметить, что из почти 300 тысяч видов растений на Земле только около 10% были исследованы на разные виды биологической активности, что указывает на огромный потенциал ранее не изученных растений.

Данные литературы свидетельствуют о широком спектре биологического действия [Menut et al, 2000; Saleem et al., 2019] Cosmos bipinnatus Cav . Помимо эфирных масел, в литературных источниках описано наличие в космее дваждыперистой других классов соединений, потенциально обладающих антимикробной активностью (флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества и др.). Однако не описано экспериментальных исследований антимикробной активности суммарных водных и водно-спиртовых экстрактов космеи дваждыперистой [Menut et al., 2000; Olajuyigbe, Ashafa, 2014; Malaka et al., 2015; Saleem et al., 2019].

Известно, что эфирное масло космеи дваждыперистой оказывает значительный ингибирующий эффект в отношении грамотрицательных и грамположительных культур. Минимальная ингибирующая концентрация для грамположительных штаммов колеблется от 0.16 до 0.31 мг/мл, тогда как показатель для грамотрицательных бактерий находится в интервале от 0.31 до 0.63 мг/мл. Эфирное масло Cosmos bipinnatus Cav . преимущественно состоит из монотерпенов (69.62%) и сесквитерпенов (22.73%) [Botsaris, 2007; Kaisoon, Konczak, Siriamornpun, 2012].

Цель исследования – изучение активности экстрактов из цветков Cosmos bipinnatus Cav . сортов ‘Rosea’ и ‘Dazzler’ в отношении некоторых, клинически выделенных, представителей условно-патогенной флоры.

Материалы и методы исследований

Учитывая перспективность Cosmos bipinnatus Cav ., мы получили экстракты из цветков сортов ‘Rosea’ и ‘Dazzler’ (экстрагент – спирт этиловый 70%, лабораторные шифры – соответственно экстракт № 5 и экстракт № 6); водные экстракты из цветков сортов ‘Rosea’ (шифр – экстракт № 11) и ‘Dazzler’ (шифр – экстракт № 12).

В качестве тест-культур использовали клинические штаммы: Klebsiella pneumoniaе SES 11/02 и Escherichia coli 89 (выделены из кишечника), Staphylococcus aureus II и Streptococcus pneumoniaе UEV-1 (выделены из трофических язв больных). Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью стрипов для биохимической идентификации микроорганизмов API 20E, API Staph, API 20 Strep (bioMérieux, Франция) с помощью программно-аппаратного комплекса BIOMIC V3 (Giles Scientific, США). Клинические штаммы любезно предоставлены авторам сотрудниками «СЭС» г. Астрахани и

ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» Минздрава России (с 01.04.2022 реорганизован в форме присоединения к ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России).

Для культивирования штаммов, выделенных из клинического материала, использовали набор коммерческих реагентов для бактериологических исследований (питательные среды): питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон) производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск (ФБУН ГНЦ ПМБ), РУ № ФСР 2007/00002; питательная среда для выделения стафилококков сухая «Стафилококкагар» (ФБУН ГНЦ ПМБ), РУ № ФСР 2011/10007; набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо-ГРМ)» (ФБУН ГНЦ ПМБ), РУ № ФСР 2007/00375; питательная среда для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов сухая (ГБМ-агар) (ФБУН ГНЦ ПМБ). Питательные среды готовили в соответствии с инструкцией производителя.

Оборудование, использованное в работе: бокс микробиологической безопасности (БМБ-II-“Ламинар-С”-1,2, РФ), центрифуга (СМ-6М, Франция), термостат (Memmert, Германия), денситометр (DЕN–1 Biosan РФ), счётчик колоний лабораторный (СКМ–1, Россия), чашки Петри, пробирки, бактериологические петли, механические дозаторы, наконечники для дозаторов.

С целью выбора адекватного препарата сравнения определяли чувствительность тест-штаммов к ряду антибиотиков, применяемых в клинической практике. Для приготовления взвеси бактериальных клеток использовали суточные тест-культуры. Для этого готовили суспензию, содержащую 1.5 x 10 8 КОЕ/мл. Около 3–4 мл взвеси выливали на поверхность плотной среды АГВ (ООО «НИЦФ», Санкт-Петербург, РФ) в чашки Петри. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 40 мин. и накладывали диски с антибиотиками. Далее чашки Петри помещали в термостат и инкубировали при +37°С в течение 24 ч. Учет результатов вели по диаметру зон задержки роста культуры в соответствии со стандартами производителя дисков (ООО «НИЦФ» Санкт-Петербург, РФ) [ГФ XIV, 2018].

Для исследования антибактериальной активности извлечений готовили серии разведений. Были сформированы ряды с концентрациями изучаемых экстрактов: 0.96 мкг/мл, 0.8 мкг/мл, 0.64 мкг/мл, 0.32 мкг/мл, 0.16 мкг/мл, 0.08 мкг/мл. 0.04 мкг/мл, 0.02 мкг/мл. Препараты сравнения в концентрации: 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл. Контролем служили пробирки с мясо-пептонным бульоном без возбудителя (контроль стерильности среды), с мясо-пептонным бульоном и исследуемым штаммом (положительный контроль). Взвесь бактерий каждого штамма была приготовлена из суточных культур. Использовали 0.2 мкл суспензии бактерий (0.5 по McFarland), которые добавляли в каждую пробирку с разведением исследуемого экстракта, препарата сравнения, пробирки с контролем роста. Далее посевы инкубировали в термостате при температуре +37ºС, проводили визуальную оценку: наличие мутности, пленки, взвесей, изменение цвета среды и др. Далее пробирки центрифугировали при 1 500 об/мин в течение 10 мин., удаляли надосадочную жидкость, а осадок промывали стерильным физиологическим раствором. Из каждой пробирки высевали по 0.02 мкл осадка на чашки Петри, содержащие соответствующую тест-культуре питательную среду. Инкубацию проводили в течение суток при температуре +37ºС, после чего подсчитывали выросшие колонии на лабораторном счётчике колоний, что позволяло сделать выводы об изменении жизнеспособности культуры под действием экстрактов [Навашин, Фомин, 1974]. Каждый высев осуществляли не менее чем в шести повторностях. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы «BioStat-2009» (Analist Soft Ins., США).

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследований была изучена чувствительность тест-культур к наиболее часто применяемым антибиотикам.

В качестве препарата сравнения выбраны: азитромицин для S. aureus и S. pneumoniae; цефтриаксон для E. coli и K. pneumoniae, так как все используемые тест-штаммы обладали чувствительностью к данным препаратам.

После подбора препаратов сравнения сформированы ряды разведений и проведен посев культур на жидкие питательные среды. Через сутки инкубации провели визуальную оценку характеристик среды в каждой пробирке, при этом отмечали степень прозрачности среды, наличие или отсутствие взвеси, осадка, пленки на поверхности – любой показатель, свидетельствующий о степени или отсутствии роста тест-культуры (табл. 1).

Как видно из данных табл. 1, в пробирках с экстрактами № 5, 6, 11 в диапазоне концентраций 0.96– 0.16 мкг/мл, и в пробирках с препаратом сравнения в концентрациях 128–8 мкг/мл отмечалась меньшая мутность среды. Экстракт № 12 визуально активности не показал.

В отношении штамма S. pneumoniae UEV-1 экстракт № 12 визуально активности, как и в первом слу- чае, не проявлял. В пробирках с экстрактом № 6 прозрачность среды наблюдалась при концентрациях 0.96–0.32 мкг/мл, что сопоставимо с препаратом сравнения в концентрациях 128–32 мкг/мл (табл. 2).

Таблица 1

Результаты посевов в мясо-пептонном бульоне S. aureus II [Results of sowing in meat-peptone broth S. aureus II ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
Экстракт № 5	++	++	++	+ +	+ +	+ ++	+ + +	+ ++
Экстракт № 6	++	++	++	+ +	+ +	+ ++	+ ++	+ + +
Экстракт № 11	++	++	++	+ +	+ +	+ ++	+ ++	+ + +
Экстракт № 12	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +	+ ++	+ + +	+ ++
Азитромицин	Концент			рация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ ++	+ + +	+ ++
Контроль	+ + +

Примечание. В табл. 1–4 «–» – полная прозрачность среды (отсутствие роста); «+» – слабый рост; «++» – умеренный рост; «+++» – интенсивный рост.

Таблица 2

Результаты посевов в мясо-пептонном бульоне S. pneumoniae UEV-1 [Results of sowing in S. pneumoniae UEV-1 meat-peptone broth]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
Экстракт № 5	++	++	++	++	+ +	+ +	+ +	+ +
Экстракт № 6	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +	+ + +
Экстракт № 11	++	+ +	++	++	+ +	+ +	+ +	+ ++
Экстракт № 12	+ + +	+ + +	+ ++	+ + +	+ ++	+ + +	+ ++	+ +
Азитромицин	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	+	+	+	+ +	+ +	+ +	+ +	+ ++
Контроль	+ + +

При визуальной оценке результатов посева в жидкую питательную среду E.coli 89 выявлена активность экстракта № 12 при всех концентрациях, кроме 0.02 мкг/мл, тогда, как в отношении грамположи-тельной флоры внешних признаков активности не наблюдали. Экстракты № 5, 6, 11 были активны в диапазоне концентраций 0.96–0.16 мкг/мл, что соответствовало активности цефтриаксона при 128–16 мкг/мл (табл. 3).

Таблица 3

Результаты посевов в мясо-пептонном бульоне E. coli 89 [Results of sowing in meat-peptone broth E. coli 89 ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
Экстракт № 5	++	++	++	++	++	+++	+++	+++
Экстракт № 6	++	++	++	++	++	+++	+++	+++
Экстракт № 11	++	++	++	++	++	+++	+++	+++
Экстракт № 12	++	++	++	++	++	++	++	+++
Цефтриаксон	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	++	++	++	++	+++	+++	+++	+++
Контроль	+++

Скрининг в отношении K. pneumoniae SES 11/02 показал наличие бактериостатической активности всех экстрактов в диапазоне концентраций 0.96–0.08 мкг/мл. В сравнении с экстрактами препарат сравнения цефтириаксон проявил меньшую активность. Угнетение роста культуры до «умеренного» наблюдали лишь при его высоком содержании в пробирках (табл. 4).

Пересев культуры после инкубации с экстрактами на твердые питательные среды позволяет провести количественные исследования и сделать окончательные выводы о жизнеспособности тест-культур после воздействия исследуемых субстанций.

Таблица 4

Результаты посевов в мясо-пептонном бульоне K. pneumoniae SES 11/02 [Results of sowing in meat-peptone broth K. pneumoniae SES 11/02 ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
Экстракт № 5	++	++	++	++	++	++	++	++
Экстракт № 6	++	++	++	++	++	++	+++	+++
Экстракт № 11	++	++	++	++	++	++	++	++
Экстракт № 12	++	++	++	++	++	++	++	++
Цефтриаксон	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Контроль	+++

Исследование жизнеспособности S. aureus II выявило высокую активность экстрактов № 5, 11 и 12 (в отличие от первого этапа). Их МПК 50 отмечали при концентрации 0.08 мкг/мл. Экстракт № 6 обладал наименьшей активностью (табл. 5, рис. 1А).

А

Рис. 1. Активность исследуемых экстрактов в отношении S. aureus II (А) и S. pneumonia UEV-1 (В) [Activity of the studied extracts against S. aureus II (A) and S. pneumonia UEV-1 (B) ]

0,96/128 0,8/64 0,64/32 0,32/16 0,16/8 0,08/4 0,04/2 0,02/1

Концентрация, мкг/мл

—•—ЭК5 -в-ЭК6 -*—ЭКИ -и—ЭК 12 -ж—Азитромицин

В

Таблица 5

Активность исследуемых извлечений в отношении S. aureus II [Activity of the studied extracts in relation to S. aureus II ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
	Количество колоний
Экстракт № 5	341±2.40	359±1.87	370±1.60	402±1.97	424±2.35	490±2.66	509±3.21	525±2.86
Экстракт № 6	289±2.07	304±2.99	459±1.94	544±2.79	561±2.66	602±1.83	603±3.72	681±2.40
Экстракт № 11	380±2.50	390±2.48	399±2.52	410±5.85	434±2.66	480±2.66	489±1.72	499±2.59
Экстракт № 12	303±2.99	390±2.34	408±1.86	410±3.22	446±1.97	453±1.97	498±0.81	501±0.89
Азитромицин	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	410±0.52	450±1,60	469±0,75	480±1,33	501±0,75	516±1,51	542±2,07	556±1,51
Контроль	987±1.33

В отношении S. pneumoniae UEV-1 менее активным оказались экстракты № 12 и 11; в диапазоне концентраций 0.96–0.32 мкг/мл процент подавления роста составлял 63–60%. Наибольшую активность показал экстракт № 6 при концентрации 0.16 мкг/мл, что сопоставимо с препаратом сравнения в концентрации 8 мкг/мл (табл. 6, рис. 1 В).

В отношении E.coli 89 очень высокую бактериостатическую активность показал экстракт № 12, где степень подавления роста относительно контроля составила 70%, что соответствует наименьшей иссле- дованной концентрации 0.02 мкг/мл. Экстракты № 6 и 11 были относительно менее активны, но не уступали препарату сравнения (табл. 7, рис. 2 А).

0,96/12 8 0,8/64 0,64/32 0,32/16 0,16/8   0,08/4   0,04/2   0,02/1

Концентрация, мкг/мл

*ЭК5 -е-ЭКб -*-ЭК11 -И-ЭК12 * Цефтриаксон А

В

Рис. 2. Активность исследуемых экстрактов в отношении E.coli 89 (А) и K. pneumonia SES 11/02 (В) [Activity of the studied extracts against E.coli 89 (А) и K. pneumonia SES 11/02 (В) ]

Таблица 6

Активность исследуемых извлечений в отношении S. pneumoniae UEV-1 [Activity of the studied extracts against S. pneumoniae UEV-1 ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
	Количество колоний
Экстракт № 5	418±1.22	421±1.83	440±1.03	451±0.82	456±0.82	467±1.37	480±1.09	489±0.75
Экстракт № 6	190±1.26	223±1.03	240±1.37	329±0.75	310±2.14	404±1.83	410±1.09	432±1.63
Экстракт № 11	408±1.22	419±1.17	450±1.22	445±1.47	480±2.42	498±1.33	501±1.03	535±0.63
Экстракт № 12	410±1.03	432±1.33	438±0.98	450±1.03	550±2.19	597±1.26	620±2.14	697±1.17
Азитромицин	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	42±1.63	86±1.03	101±0.89	201±0.82	397±1.63	426±1.21	462±1.33	477±0.75
Контроль	1189±1.51

Таблица 7

Активность исследуемых извлечений в отношении E. coli 89 [Activity of the studied extracts against E. coli 89 ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
	Количество колоний
Экстракт № 5	312±1.83	333±1.38	329±0.75	348±0.98	367±0.98	378±1.09	394±1.17	458±1.38
Экстракт № 6	285±0.75	350±1.03	352±1.33	390±0.75	490±1.03	501±0.75	500±1.03	505±2.14
Экстракт № 11	398±0.82	419±1.03	435±0.75	458±0.82	486±0.75	490±1.03	509±0.75	519±0.63
Экстракт № 12	188±0.75	190±1.03	199±1.03	210±1.03	240±0.75	245±0.75	250±0.84	290±0.75
Цефтриаксон	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1
	414±1.09	450±0.82	458±1.05	470±0.75	481±1.03	490±0.75	500±1.03	503±1.26
Контроль	890±0.82

Все исследуемые экстракты активно подавляли рост K. pneumoniae SES 11/02. Экстракт № 5 действовал менее активно: в диапазоне концентраций 0.96–0.64 мкг/мл процент подавления роста составлял от 63–60%. Экстракты № 6, 11, 12 были более активны: при минимальной концентрации (0.02 мкг/мл) подавляли рост тест-культуры на 60%.

Препарат сравнения существенно уступал исследуемым экстрактам (табл. 8, рис. 2 В).

Таблица 8

[Activity of the studied extracts in relation to K. pneumoniae SES 11/02 ]

Извлечения	Концентрация извлечений, мкг/мл
	0.96	0.8	0.64	0.32	0.16	0.08	0.04	0.02
	Количество колоний
Экстракт № 5	410±0.84	431±1.75	444±1.03	461±0.75	479±1.05	480±1.03	507±0.98	532±0.98
Экстракт № 6	310±0.75	350±1.03	380±1.03	390±1.03	390±0.84	395±1.21	397±0.52	410±1.75
Экстракт № 11	309±1.03	330±1.94	339±1.05	360±1.03	381±0.75	390±0.82	398±0.75	420±0.75
Экстракт № 12	290±1.05	300±0.75	310±0.84	315±1.21	345±1.38	350±0.82	387±0.98	410±1.03
	Концентрация препарата сравнения, мкг/мл
Цефтриаксон	128	64	32	16	8	4	2	1
	390±0.75	398±0.75	417±0.63	444±1.26	476±0.98	489±0.75	492±0.84	501±0.75
Контроль	1106±1.17

Активность исследуемых извлечений в отношении K. pneumoniae SES 11/02

Заключение

В результате проведенных скрининговых исследований среди вновь полученных экстрактов из цветков космеи дваждыперистой ( Cosmos bipinnatus Cav . ) сортов ‘Rosea’ и ‘Dazzler’, выявлены экстракты, обладающие активностью в отношении условно-патогенной флоры. Установлено, что все изученные экстракты в разной степени обладают способностью подавлять рост тест-микроорганизмов.

Экстракт № 12 обладает бактериостатической активностью в отношении S. aureus в диапазоне концентраций 0.96–0.32 мкг/мл. В отношении E. coli при всех изученных концентрациях экстракта процент подавления роста был не ниже 67% при самой низкой концентрации (0.02 мкг/мл), а препарат сравнения демонстрировал действие лишь при высокой концентрации (128 мкг/мл).

В отношении K. pneumoniae экстракт № 12 уже при наименьшей концентрации (0.02 мкг/мл) подавлял рост культуры на 65%, а препарат сравнения лишь при концентрации 64 мкг/мл показал процент подавления роста на 65%.

Экстракт № 6 обладал бактериостатической активностью в отношении S. pneumoniae во всех изученных концентрациях (0.96–0.02 мкг/мл) и уступал по действию только препарату сравнения в диапазоне концентраций 128–8 мкг/мл.

Экстракты № 5 и 11 сопоставимы между собой по действию в отношении S.aureus и S. pneumoniae . При высоких концентрациях процент подавления роста находился на уровне 65%, а при низких – на уровне 50%.

В отношении E. coli экстракт № 5 демонстрировал бактериостатическое действие в диапазоне концентраций 0.96–0.32 мкг/мл, когда препарат сравнения уступал по действию и проявлял активность только в высокой дозе (128 мкг/мл) на уровне МПК 55 .

В отношении штамма K. pneumoniae экстракт № 5 проявил сниженную активность на уровне 63–53% (в диапазоне 0.96–0.02 мкг/мл), однако мало отличающуюся от уровня препарата сравнения 65–55% (в диапазоне 128–1 мкг/мл).

Результаты исследования экстракта № 11 в отношении E. coli показали менее интенсивное воздействие при концентрации 0.96 мкг/мл, что соответствовало МПК 55 и не отличалось от действия препарата сравнения цефтриаксон.

В отношении K. pneumoniae экстракт № 11 показал способность подавлять рост тест-культуры на 72% при концентрации 0.96 мкг/мл и на 62% – при низкой концентрации (0.02 мкг/мл), что соответствовало высокой дозировке препарата сравнения.

Таким образом, микробиологический скрининг вновь полученных экстрактов показал, что при исследованных дозировках экстракты проявляют бактериостатическую активность как в отношении грампо-ложительной, так и в отношении грамотрицательной флоры. Несомненным лидером является экстракт № 12 (водный экстракт из цветков сорта ‘Dazzler’), проявивший активность в отношении почти всех изученных штаммов, в большинстве случаев превосходящую активность препаратов сравнения.

Кроме этого, необходимо отметить, что исследованные нами экстракты проявляли наиболее интенсивное действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

Следует учесть, что исследовали активность экстрактов при очень низких концентрациях, тогда как для препарата сравнения был взят стандартный ряд разведений. Это позволяет предполагать, что извлечения из цветков Cosmos bipinnatus Cav . обладают выраженным бактериостатическим, а при более высоких концентрациях бактерицидным действием и являются перспективными для дальнейшей разработки.