Антибиопленочные свойства прототипов тонкопленочных покрытий для ортопедических имплантатов из титана и его сплавов, содержащих нано-частицы оксида меди: экспериментальное исследование

EDN: KJEYCW

Corresponding author — Vladimir Yu. Ulyanov

Тел.: +7 (917) 2140870

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis , а также Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli . При этом бактериостатические свойства покрытий, обусловленные их морфологией и физико-химическими свойствами, должны действовать в течение всего времени пребывания имплантата в организме, предупреждать колонизацию микробных биопленок и не разрушаться, постепенно высвобождая активные компоненты в перипротезные ткани [1].

Для получения бактериостатических покрытий ортопедических имплантатов используются различные способы, включая пассивную обработку абиотической поверхности с антиадгезивными свойствами с возможной последующей элюцией антимикробных препаратов или созданием биодеградируемых покрытий, что обеспечивает временный эффект. С целью реализации пролонгированного антимикробного воздействия поверхности ортопедических имплантатов физически или химически модифицируют с целью изменения кристаллической фазы оксидов металлов, образующихся в виде новых слоев. Новая морфология этих покрытий, не влияя на остеоинтеграцию, может обеспечивать снижение микробной колонизации [2, 3].

Перспективным направлением разработок в области медицинского материаловедения и борьбы с биопленкообразованием в настоящее время является применение CuO для так называемого контактного уничтожения (contact killing) микроорганизмов на поверхностях, в том числе создание поверхностных нанокомпозитных покрытий на основе аморфной пленки, включающей наночастицы Cu, наносимой на покрытия из титана Ti через источник кластеров газовой агрегации. Описано также, что на поверхностях из полиэтилена с алмазоподобным углеродным покрытием, выполненным из Cu, противомикробный эффект был более выраженным, чем на таком же покрытии, не содержащим Cu [4]. Описывается также наличие бактериостатического эффекта тонких пленок Ti-Cu, сочетающееся с ростом остеобластических клеток [5]. Все эти покрытия обладают выраженными бактериостатическими свойствами и не вызывают цитотоксичности [6].

Для еще большего повышения антимикробной активности покрытий из сплава Ti-Cu используется ультразвуковое микродуговое окисление, оказывающее, по данным литературы, бактерицидное воздействие более чем на 99% клинических штаммов Staphylococcus spp . Существуют также покрытия из Ti и его сплавов, в том числе содержащие СuO, полученные методом электрохимического оксидирования. Последний метод является трудоемким и вре-мязатратным, а формируемое таким образом покрытие может содержать токсичные серосодержащие примеси [7].

Таким образом, разработка тонкопленочных покрытий для ортопедических имплантатов на основе наночастиц CuO с пролонгированными сроками биоцидного воздействия на абиотические поверхности и перипротезные ткани, а также оценка их бактериостатических и антибиопленочных свойств является перспективным направлением для травматологии и ортопедии.

Цель — оценить бактериостатические свойства разработанных прототипов тонкопленочных покрытий для ортопедических имплантатов из титана и его сплавов.

Материал и методы. Материалом для исследования стали тонкопленочные покрытия, содержащие в составе однокомпонентные порошки биоцидных наночастиц CuO, которые изготовлены в соответствии с сертификатом, разработанным ООО «Передовые порошковые технологии» (г. Томск, Россия) согласно ТУ 1791-003-36280340-2008, и предназначены для нанесения на ортопедические имплантаты, выполненные из титана и его сплавов. Паспорт безопасности СuO соответствует директиве Европейского сообщества 91/155, производителем и поставщиком наночастиц является ООО «Передовые порошковые технологии». В составе тонкопленочного покрытия также были использованы N-ацетилцистеин (АЦЦ) и химотрипсин (ХС) в качестве компонентов, уменьшающих бактериальную адгезию и способствующих разрушению матрикса биопленок (заявка на выдачу патента РФ №2023117375, вход №W23037127 от 30.06.2023, выдан Федеральной службой по интеллектуальной собственности ФГБУ «Федеральный институт промышленной собственности»).

Тонкопленочное покрытие формировали поэтапно путем предварительной пескоструйной обработки поверхности металлической подложки частицами алюминия с фракцией 150–400 мкм; очистки от технологических загрязнений в водном растворе поверхностно-активных веществ с использованием ультразвуковой ванны; микродугового оксидирования в анодном режиме при плотностях тока 2–2,5×103 А/м2 продолжительностью 30 мин в водном щелочном электролите, содержащем 3-4 г/л NaOH с добавлением в него 10 мас.% CuO при комнатной температуре и барботаже воздуха в пузырьковом режиме при скорости 0,1-0,4 м/с; сушки покрытия и равномерного нагрева подложки в сушильном шкафу при температуре 600°С в течение 30 мин с принудительной конвекцией.

Толщину слоев покрытий прототипов определяли с помощью настольного сканирующего электронного микроскопа EXlorer (Aspex Corp., США) (Ре-естрИнформ, №13908, организация: Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю. А.) в программе анализа геометрических параметров микрообъектов Metallograph.

Бактериостатические свойства прототипа покрытия, нанесенного на изделие, выполненное из титана и его сплавов Ti6Al-4V, ASTM F1472 и имеющего поверхностный слой, представленный композицией, состоящей из 5% водного раствора поливинил-пирролидона, содержащей активное действующее вещество в виде 0,5 мас.% наночастиц CuO с дисперсностью 50–70 нм, а также АЦЦ — 0,3 мас. % и ХС — 0,01 мас. %, исследовали на примере образцов, полученных механически с помощью пробойника. Для этого из пластин размером 11×19 мм формировали диски диаметром 10 мм, толщиной 2 мм и весом 0,016±0,001 г. Изучали также бактериостатические свойства отдельных компонентов прототипа покрытия, а именно наночастицы CuO (1), АЦЦ (2), ХС (3).

Объект исследования составили 65 клинических штаммов микроорганизмов, возбудителей перипротез-ной инфекции (ППИ) в том числе 15 — S. epidermidis, 15 — S. aureus, 20 — P. aeruginosa и 15 — E. coli , выделенных у 60 пациентов обоего пола в возрасте 63,8±4,6 года, проходивших лечение в НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России в связи с осложнениями, связанными с внутренними ортопедическими протезными устройствами, имплантатами и трансплантатами (Т84 по Международной классификации болезней 10-го пересмотра). Идентификация выделенных штаммов проведена при помощи микробиологического анализатора BBL Auto Reader (Becton Dickinson, США). В качестве группы сравнения использовали референсные штаммы S. epidermidis (АТСС 12228), S. aureus (АТСС 25923), P. aeruginosa (АТСС 27853) и E. coli (АТСС 25922) из коллекции Becton Dickinson, США.

Чувствительность клинических и референсштаммов к исследуемым образцам изучали в модификации стандартного диско-диффузионного метода в соответствии c МУК 4.2.1890–04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», принимая во внимание последние рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST) [8]. Располагая диски равноудаленно друг от друга в чашках Петри, содержащих инокулированный исследуемыми штаммами Mueller — Hinton аgar (Becton Dickinson, США), измеряли зоны задержки роста, вычисляя средние значения для 20 измерений в трех сериях экспериментов.

Особенности влияния исследуемых образцов изделия на адгезивные свойства микроорганизмов и кинетику формирования ими биопленок изучали согласно методологии, предложенной G. D. Christensen и соавт. [9]. Исходный раствор содержал концентрацию элементов, соответствующую 1 мг/мл.

Формирование моновидовых микробных биопленок осуществляли в статичных условиях в стерильных полистироловых 96-луночных планшетах (Медполимер, Россия, регистрационное удостоверение на медицинское изделие «Планшет полистироловый для иммуноферментного анализа по ТУ 9398-058-00480230-2009» от 13.05.2019 г. №РЗН 2015/2665). Результаты оценивали с учетом МР 4.2.0161-19 «Методы индикации биологических пленок микроорганизмов на абиотических объектах».

Использовали 18-часовые суспензии бактериальной культуры клинических изолятов и референсных штаммов 5*106 КОЕ/мл, эквивалентные 0,5 по стандарту МакФарланда в ГРМ-бульоне с глюкозой, которые в дальнейшем использовали также в качестве положительного контроля. Стерильный ГРМ-бульон использовали в качестве отрицательного контроля.

Элементы покрытия, содержащиеся в ГРМ-бульоне, смешивали с бактериальной суспензией в стерильных пробирках, после чего вносили по 150 мкл в лунки полистиролового планшета и инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Контрольные лунки не содержали бактериальной взвеси. Затем планшеты промывали 3 раза 0,9% раствором натрия хлорида, после чего в каждую из лунок добавляли 0,1% водный раствор генцианового фиолетового красителя, отставляя его на 30 мин при температуре 22–25°C. После трехкратного промывания лунок планшета 0,9% раствором натрия хлорида в каждую из них вносили по 200 мкл 95° этилового спирта на 30 мин. По окончании инкубации проводили измерение оптической плотности (ОП) полученных элюатов кристаллического фиолетового красителя на спектрофотометре Epoch (BioTech, США, регистрационное удостоверение от 03.11.2010 №ФСЗ 2010/08269) при длине волны 620 нм и представляя полученные результаты в виде условных единиц ОП.

Ростовые свойства штаммов микроорганизмов изучали после 60-минутной инкубации бактериальной суспензии с элементами покрытия в той же концентрации с последующим высевом на твердые среды и инкубацией при 37°С в течение 24 ч, подсчитывая КОЕ/мл.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 12.0. Проверку вариационных рядов на нормальность распределения выполняли по критерию Шапиро — Уилка и Колмогорова — Смирнова. Распределение значений толщины слоев покрытия соответствовало нормальному, значения представляли в виде M±SD , где M — среднее значение, SD — стандартное отклонение. Характеристики бактериостатических свойств покрытия не соответствовали закону о нормальном распределении, в связи с чем данные указывали в виде медианы ( Ме ) и интерквартильного размаха 25 и 75%. Для сравнения результатов применяли непараметрический U -критерий Манна — Уитни. Различия считали значимыми при p <0,05, что соответствует требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.

Результаты. Прототип тонкопленочного покрытия формировали поэтапно путем предварительной пескоструйной обработки поверхности металлической подложки частицами алюминия с фракцией 150-400 мкм; очистки от технологических загрязнений в водном растворе поверхностно-активных веществ с использованием ультразвуковой ванны; микродугового оксидирования в анодном режиме при плотностях тока 2-2,5*10 3 А/м² продолжительностью 30 мин в водном щелочном электролите, содержащем 3-4 г/л NaOH с добавлением в него 10 мас.% CuO при комнатной температуре и барботаже воздуха в пузырьковом режиме при скорости 0,1-0,4 м/с; сушки покрытия и равномерного нагрева подложки в сушильном шкафу при температуре 600°С в течение 30 мин с принудительной конвекцией. При осуществлении измерений толщины слоев покрытий прототипов методом сканирующей электронной микроскопии для них были определены следующие значения: для TiO₂— 6±1 мкм, TiO₂ и CuO — 6±1 мкм.

При изучении бактериостатических свойств отдельных компонентов прототипа тонкопленочного покрытия в отношении референсных штаммов установлено, что максимальные значения диаметров зон подавления роста были достигнуты при применении вариантов тонкопленочного покрытия, включавшего в себя наночастицы CuO, стабилизированные поли-винилпирролидоном (табл. 1).

Таблица 1

Диаметр зон подавления роста референсных штаммов микроорганизмов прототипом тонкопленочного покрытия и отдельными его компонентами, мм

Вариант покрытия	Состав покрытия/ референсный штамм	S. aureus АТСС 25923	S. epidermidis АТСС 12228	E. coli АТСС 25922	P. aeruginosa АТСС 27853
1	CuO	13 (12; 13)	14 (13; 14)	14 (13; 14)	9 (9,0; 10,0)
2	АЦЦ	4 (3; 4) * p 1-2= 0,00034	5 (4; 5) * p .2 =0,00078	4 (4; 5) * p .2 =0,00062	1 (1; 1) * p 1-2=0,00078
3	ХТ	4 (3; 4) p 1–3=0,0039	4 (3; 4) p 1–3=0,0017	3 (2; 3) p 1–3=0,0017	4 (3; 4) p 1–3=0,0039
4	CuO+АЦЦ+ХТ	12 (11; 12) p =0,0090 p 2–4=0,0017	12 (11; 12) p =0,00078 p 2–4 =0,0028	13 (13; 14) p =0,00073 p 2–4 =0,0021	10 (10; 11) p =0,00068 p 2–4 =0,0049

Примечание: результаты представлены в виде медианы ( Ме ), 25 и 75% квартилей; * р — уровень статистической значимости между бактериостатическим действием различных компонентов прототипа тонкопленочного покрытия и референсными штаммами микроорганизмов при р <0,05.

Зоны подавления роста у референс-штаммов S. aureus, S. epidermidis и E. coli при использовании полнокомпонентного прототипа тонкопленочного покрытия были несколько менее выражены, чем при применении варианта покрытия, содержащего лишь CuO и поливинилпирролидон, однако различия не достигали уровня статистической значимости.

Особенности бактериостатического действия прототипа полнокомпонентного тонкопленочного покрытия в отношении клинических штаммов представлены в табл. 2.

Как следует из полученных результатов, наночастицы CuO оказывали бактериостатическое действие на клинические штаммы бактерий.

Влияние прототипа покрытия на адгезивные свойства и биопленкообразование референсных и клинических штаммов имело ряд особенностей (табл. 3).

Способность к пленкообразованию среди референсных штаммов микроорганизмов была более выражена у S. aureus АТСС 25923 по сравнению с E. coli АТСС 25922 и P. aeruginosa АТСС 27853, а у S. epidermidis АТСС 12228 превышала таковую у P. aeruginosa АТСС 27853. Различия отмечали между клиническими штаммами S. aureus и P. aeruginosa.

Проведение инкубации исследуемых штаммов с прототипом тонкопленочного покрытия приводила к ингибированию способности к адгезии и формированию биопленок (табл. 4).

Согласно полученным результатам инкубация клинических штаммов с прототипом тонкопленочного покрытия приводила к значимому снижению

Таблица 2

Диаметр зон подавления роста клинических штаммов микроорганизмов прототипом тонкопленочного покрытия и отдельными его компонентами, мм

Вариант покрытия	Компонент покрытия/клинические штаммы	S. aureus n =15	S. epidermidis n =15	E. coli n =15	P. aeruginosa n =20
1	CuO	13 (12; 13)	13 (13; 14)	14 (14; 15)	10 (9,0; 10,0)
2	АЦЦ	3 (2; 3) * p 1-2= 0,0039	4 (3; 4) * p 1-2= 0,0039	4 (4; 4) * p 1-2= 0,0018	2 (1; 2) * p 1-2<=0,00042
3	ХТ	3 (3; 4) * p 1-3= 0,0018	5 (4; 5) * p 1-3=0,0040	3 (2; 3) * p 1-3= 0,00078	2 (2; 3) * p 1-3=0,00078
4	CuO+АЦЦ+ХТ	16 (15; 16) * p 2 _4= 0,00078 p 2–4= 0,0008	15 (15; 15) * p 2 _4= 0,0018 p 2–4= 0,0017	13 (12; 13) * p 2 _4= 0,00078 * p .;=0,0061	14 (14; 15) * p, ,=0,00035 * p ^=0,00058

Примечание: результаты представлены в виде медианы ( Ме ), 25 и 75% квартилей; * p — уровень статистической значимости различия между влиянием отдельных компонентов прототипа тонкопленочного покрытия на клинические изоляты возбудителей ППИ при р <0,05.

Таблица 3

Уровни оптической плотности генцианового фиолетового красителя клинических и референсных штаммов микроорганизмов до воздействия на них прототипа тонкопленочного покрытия, у. е.

Виды штаммов	Значения ОП генцианового фиолетового красителя, у. е.	Уровень р
S. aureus АТСС 25923	0,091 (0,089; 0,091)	—
S. epidermidis АТСС 12228	0,088 (0,079; 0,092)	р 1–2=0,712
E. coli АТСС 25922	0,084 (0,073; 0,089)	p =0,694 p 12––33=0,911
P. aeruginosa АТСС 27853	0,071 (0,066; 0,073)	* p =0,045 * p 2-4=0,047 * p 3-4 =0,049
S. aureus клинические	0,604 (0,565; 0,683)	* p =0,0039 * p 2 ,=0,00077 * p "=000068 * p 4^ =0,00051
S. epidermidis клинические	0,578 (0,564; 0,599)	* p =0,0044 * p, „=0,00089 , * p =000074 * p 4- 6=0,00062
E. coli клинические	0,584 (0,561; 0,596)	* p . =0,0055 * p, - =0,00096 * p "=000082 * p 4 . =0,00070
P. aeruginosa клинические	0,473 (0,441; 0,535)	* p =0,00084 * p ,"„=000024 * p "„=000035 * p =000041 * p 5-8 = 0,039

Примечание: результаты представлены в виде медианы ( Ме ), 25 и 75% квартилей; * p — уровень статистической значимости различий адгезивных свойств и способности к образованию бактериальных биопленок между референсными штаммами и клиническими изолятами возбудителей ППИ при р <0,05.

адгезивных свойств и способности к образованию биопленок следующими клиническими штаммами: S. aureus на 10,6%), S. epidermidis — на 37,9% и P. aeruginosa — на 6,8%.

60-минутное воздействие компонентов прототипа тонкопленочного покрытия на исследуемые штаммы микроорганизмов оказывало ингибирующее действие на их ростовые свойства, что подтверждалось при последующем высеве на твердые питательные среды (табл. 5).

Прототип тонкопленочного покрытия ингибировал рост референсных штаммов микроорганизмов S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922, P. aeruginosa АТСС 27853 на 6,6; 22,5 и 7,3% соответственно, а также снижал ростовые способности S. aureus — на 12,7%, S. epidermidis — на 13,3% и P aeruginosa — на 6,3%.

Таблица 4

Уровни оптической плотности генцианового фиолетового красителя после завершения инкубации клинических и референсных штаммов микроорганизмов с прототипом полнокомпонентного тонкопленочного покрытия, у. е.

Виды штаммов	Значения ОП генцианового фиолетового красителя, у. е.	Уровень р
S. aureus АТСС 25923	0,086 (0,082; 0,090)	—
S. epidermidis АТСС 12228	0,083 (0,076; 0,089)	p 1–2=0,865
E. coli АТСС 25922	0,073 (0,069; 0,080)	p =0,794 p 1 2 – – 3 3 =0,780
P. aeruginosa АТСС 27853	0,071 (0,066; 0,073)	p =0,034 p 1–4=0,042 p 2 3 – – 4 4 =0,047
S. aureus клинические	0,546 (0,528; 0,567)	* р . =0,00035 * р ,",=0,00029 * р, .. =0,000088 * р 4-5 =0,000070
S. epidermidis клинические	0,419 (0,385; 0,462)	* р. „=0,00054 * р ,"„=0,00042 * р "=0,00017 * р 4 _6 =0,00011
E. coli клинические	0,560 (0,521; 0,578)	* р =0,00022 * р "=0,00014 * р. =0,000065 * р 4-7 =0,000051
P. aeruginosa клинические	0,443 (0,417; 0,468)	* р =0,00050 * р ,-8 =O0OO47 * р =0,00010 * р =0,00006 4–8

Примечание: результаты представлены в виде медианы ( Ме ), 25 и 75% квартилей; * р — уровень статистической значимости различий адгезивных свойств способности к образованию бактериальных биопленок между референсными штаммами и клиническими изолятами при р <0,05.

Таблица 5

Влияние прототипа полнокомпонентного тонкопленочного покрытия на ростовые свойства референс-штаммов и клинических изолятов-возбудителей ППИ, КОЕ/мл

Штамм/варианты опыта	До воздействия	После воздействия прототипа тонкопленочного покрытия
S. aureus АТСС 25923	2119 (2017; 2165)	1988 (1964; 1990) * р =0,0035
S. epidermidis АТСС 12228	2014 (1973; 2028)	1824 (1792; 1980) р =0,079
E. coli АТСС 25922	1216 (1182; 1234)	992 (976; 1000) * р =0,0039
P. aeruginosa АТСС 27853	1228 (1201; 1256)	1139 (1113; 1155) * р =0,015
S. aureus клинические	2241 (2227; 2269)	1988 (1964; 2001) * р =0,0078
S. epidermidis клинические	2113 (1985; 2134)	1865 (1841; 1904) * р =0,0019
E. coli клинические	1276 (1259; 1292)	1219 (1185; 1263) p =0,822
P. aeruginosa клинические	1249 (1217; 1277)	1174 (1159; 1188) * р =0,0042

Примечание: результаты представлены в виде медианы ( Ме ), 25 и 75% квартилей; * р — уровень статистической значимости различий ростовых свойств референс-штаммов микроорганизмов и клинических изолятов возбудителей ППИ до и после воздействия прототипа тонкопленочного покрытия при р <0,05.

Обсуждение. Основным материалом выбора при изготовлении имплантатов является титан, обладающий необходимыми прочностными свойствами, стойкостью к коррозии и высокой биосовместимостью [10].

Возрастающая частота случаев развития послеоперационных инфекционных осложнений при имплантации металлоконструкций способствует развитию направления исследований, связанных с разработкой модификации их поверхности путем нанесения различных препаратов с широким антимикробным спектром, что призвано существенно повысить срок «выживаемости» имплантатов [11–13].

Сложность разработки подходов к профилактике и лечению ППИ обусловлена формированием на границе взаимодействия абиотической и биотической сред в зоне имплантации бактериальных биопленок, в отношении которых традиционные методы воздействия демонстрируют сравнительно низкую эффективность [14, 15].

Изученные нами клинические изоляты возбудителей инфекционных процессов, полученные от пациентов ортопедического профиля, проявляли усиленные адгезивные свойства по отношению к абиотическим поверхностям, а также повышенную кинетику нарастания биопленки по сравнению с аналогичными референсными штаммами, о чем сообщают и другие исследователи [16].

Перспективным направлением исследований является применение нанотехнологий с адресной доставкой лекарств с программируемым высвобождением активных компонентов [17]. Известна аддитивная технология лазерного спекания сплава Ti₃Al₂V с использованием 10 мас.% Ta (10Ta) и 3 мас.% Cu (3Cu), что повышает бактериостатическую активность изделия на 78-86% по отношению к P. aeruginosa и S. aureus. Доказана эффективность данной разработки в эксперименте на крысах с переломом бедренной кости, осложненном инфекционным процессом [18].

При проведении нашего исследования были подтверждены бактериостатические свойства разработанных изделий из титана и его сплава с нанесенным на его поверхность тонкопленочным покрытием, содержащим наночастицы оксида меди с дисперсностью 50–70 нм по отношению к клиническим изоля-там S. aureus , S. epidermidis и P. aeruginosa .

G. Karabulut и соавт. в 2023 г. также применили наночастицы CuO с аналогичной дисперсностью с целью обеспечения бактериостатического эффекта медицинских изделий, выполненных из нержавеющей стали, и сообщили о положительных результатах эксперимента [19].

Разработанный нами прототип тонкопленочного покрытия позволил добиться ингибирующего влияния на адгезивные свойства и способность к формированию биопленок клиническими штаммами S. aureus, S. epidermidis и P. aeruginosa , полученными от пациентов ортопедического профиля, что подтверждает перспективность разработки подходов к его внедрению в клиническую практику.

Заключение. Разработанный прототип тонкопленочного покрытия в составе изделий из титана и его сплавов снижает факторы патогенности клинических штаммов микроорганизмов за счет выраженного бактериостатического действия и адгезивной активности, а также ингибирования способности к образованию биопленок.

Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.