Антибиотикорезистентность штаммов стафилококков, выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы у кошек

Патология мочевыделительной системы среди домашних плотоядных является одной из самых часто встречающихся. В течение последних двух десятилетий заболеваемость неуклонно растет [1], ситуация осложняется частыми рецидивами болезни [2].

Лечение пациентов с рецидивирующими заболеваниями мочевыделительной системы является серьезной проблемой, поскольку требует применения противомикроб-ных препаратов в ветеринарии, что способствует развитию резистентности микроорганизмов [3]. Для проведения действенной антибактериальной терапии необходимы достоверные данные об изменении чувствительности патогенов к антибиотикам в каждом регионе. При этом для повышения эффективности лечения мало определить антибио-тикорезистентность бактерий на фенотипическом уровне. Имея одинаковые фенотипы, но реализуя разные механизмы антибиотикорезистентности, микроорганизмы могут существенно отличаться по чувствительности к применяемым антибактериальным препаратам. Для организации тактики эффективного антибактериального лечения на на-

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48) VETERINARY AND ZOOTECHNY циональном и региональном уровнях нужны данные о распространенности бактериальных генетических детерминант резистентности [4].

Установлено преобладание разных видов стафилококков в составе микрофлоры, выделенной из мочи кошек при заболеваниях мочевыделительной системы [5].

В связи с этим, с одной стороны, представляет интерес фенотипическое исследование антибиотикорезистентности клинических изолятов стафилококков, которые преимущественно инфицируют мочевой пузырь при цистите и мочекаменной болезни, для оценки риска формирования устойчивости к антибактериальным препаратам, а с другой – молекулярно-генетическое исследование антибиотикорезистентности изолятов.

Объекты и методика исследования

В работе были использованы Staphylococcus spp . разных видов, выделенные из мочи 22 кошек с патологией мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит), находящихся на лечении в ветеринарных клиниках г. Оренбурга.

При первичном обследовании пробы мочи из мочевого пузыря с помощью катетера отбирали в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики и доставляли в лабораторию в течение одного-двух часов для проведения бактериологического исследования.

Изолировали уроштаммы классическим бактериологическим методом. Для выделения Staphylococcus spp . использовали желточно-солевой агар, куда засевали исследуемый материал. Чашки с посевами культивировали при 37°С в течение 18–24 ч.

Видовую принадлежность микроорганизмов определяли с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия) с расчетом коэффициента достоверности при использовании программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам осуществляли диско-диффузионным способом согласно [6]. В исследовании применяли стандартные диски промышленного производства, пропитанные следующими антибактериальными препаратами: азитромицин, амоксициллин/клавулановая кислота, цефазолин, цефтриаксон, цефепим, цефотаксим, энрофлоксацин, ципрофлоксацин, гентамицин, тилозин. Учет результатов проводили по диаметру зоны задержки роста тестируемых урокультур.

Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 25 штаммов стафилококков: 12 – Staphylococcus aureus, 6 – Staphylococcus sciuri, 7 – Staphylococcus in-termedius .

ДНК экстрагировали из суточной агаровой культуры стафилококков с применением набора реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия), согласно рекомендации производителя.

Амплификацию проводили на многоканальном амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия) по стандартному протоколу. Для выявления генетических детерминант резистентности применяли специфические олигонуклеотидные праймеры, описанные в научных источниках [7; 8] и синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (таблица).

Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения (рис. 1).

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48)                                                VE TE RIN A R Y A ND Z OOTE C HNY

Праймеры, используемые для обнаружения детерминант антибиотикорезистентности микроорганизмов

№	Антимикробный препарат	Ген	Праймер	Нуклеотидная п осл е д ов а тельнос ть праймеров	Размер продукта (пн)
1	Метициллин (оксациллин), цефалоспорины	mecA	mecAQF2	GGG A TC A T A GC GTCA TTA T TC C	163
			mecAQR2	C G A TGC C TA TC TC A T A TGC
2	Ампициллин, амоксиклав	blaZ	blaZ- F	ACTTCAACACCTGC TGC TT TC	170
			blaZ-R	TGACCACTTT TA TC A GCA AC C
3	Аминогликозиды: гентамицин тобрамицин, амикацин, канамицин канамицин	aac(6') aph(2'')	aac-aph-F	T TGGGAA G A TGAAGTT T TTA GA	160
			aac-aph-R	C C TT TA C TC CAA TAA TT T GGC T
		ant(4')-Ia	ant(4')-1-F	CAAAC TGC TAAA TC GGTA G AAG C C	294
			ant(4')-1-R	GG AAA GTTGA C CAG ACAT TA C G AAC T
		аph(3')-IIIa	aph(3')-IIIa-F	GGC TAAAA TG A G AA T A T CA CC GG	523
			aph(3')-IIIa-R	C T T TAAAAAA TCA TACA G C TC GC G
4	Фторхинолоны	gyrA	tnpR-F	A TGA TT T T TGGC TA TGC T C G	382
			tnpR-R	TA A G ACCA G AGT TA GTTCGT TC
		grlA	tnpA-F	ACAAC TTCT T TCTG TA G AC CAC	604
			tnpA-R	GTC T T T TA GC CAA G C G AG
5	Макролиды	ermA	ermAF	TA TCT TA TC GT TGA G AA G GG A T T	139
			ermAR	C TA CAC TTGGC TGA TGAAA
		ermB	ermBF	C TA TC TGA T TG T TGAA G AA G CA TT	141
			ermBR	GT T TA C TC T TGG T T TA GG A TCAAA
		ermС	ermCF	AA TC GTCAA TTC C TGC A TGT	299
			ermCR	TA A TC GTGGAA T A C G GG T T TG

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов при определении гена me c A . Дорожки: 1 – маркер молекулярной массы; 2 – от рица тельный контрол ь; 3–14 – тестируемые штаммы

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

Полученные результаты обработаны статистически [9]. Чтобы изучить взаимосвязь между расматриваемыми характеристиками, с помощью программы Microsoft Office Excel 2007 была определена величина коэффициента парной корреляции Пирсона анализируемых величин. Статистически значимым принимали значение коэффициента корреляции более 0,75.

Результаты исследования и обсуждение

При изучении эффективности действия антибактериальных препаратов, относящихся к разным группам по механизму действия, на стафилококки установлена абсо- лютная чувствительность данных микроорганизмов к полусинтетическим пенициллинам, коагулазоположительных штаммов (S. aureus и S. intermedius) – к аминогликозидам, S. intermedius – к цефалоспоринам и S. sciuri – к фторхинолонам и макролидам. По отношению к цефалоспоринам, фторхинолонам и аминогликозидам стафилококки разных видов характеризовались не только чувствительностью, но и умеренной рези-

Рис. 2 . Чувствительность стафилококков к антимикробным препаратам разных групп: S – чувствительный; I – умеренно устойчивый; R – резистентный

Спектр чувствительности штаммов S. aureus к отдельным антибиотикам характеризовался следующими особенностями: все изученные культуры были чувствительны к цефазолину, цефепиму, амоксиклаву и гентамицину; умеренно резистентны к ципрофлоксацину и в 66,7 ± 13,6% случаев – к тилозину. Среди изолятов золотистых стафилококков 16,7 ± 10,8% были умеренно резистентны к цефотаксиму; процент умеренно резистентных культур к цефтриаксону и энрофлоксацину был одинаков – 33,3 ± 13,6%. Установлена выраженная резистентность штаммов S. aureus к азитромицину (83,3 ± 10,8%), умеренная резистентность к данному антибактериальному препарату определена в 16,7 ± 10,8% случаев.

Высокий процент чувствительных штаммов S. intermedius и S. sciuri отмечен к цефазолину, цефепиму, амоксиклаву – 100%. Уровень чувствительности изолятов S. intermedius к цефтриаксону, цефотаксиму, гентамицину также составлял 100%, к эн-рофлоксацину, ципрофлоксацину и тилозину – 66,7 ± 17,8%, остальные штаммы были умеренно резистентными к данным антибиотикам. Штаммы S. intermedius по отношению к азитромицину характеризовались чувствительностью, умеренной резистентностью и резистентностью (33,3 ± 17,8%). Все изоляты S. sciuri характеризовались чувст-

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48)

VETERINARY AND ZOOTECHNY

вительностью к энрофлоксацину, ципрофлоксацину, азитромицину и к антибиотикам, указанным выше; 50 ± 20,4% культур – к цефтриаксону и гентамицину; в 100% случаев были умерено резистентными к тилозину и цефотаксиму.

Тот факт, что имеющиеся генетические детерминанты у микроорганизмов не всегда фенотипически проявляются, дает основание изучить распространение генетических детерминант, кодирующих антибиотикоустойчивость, среди выделенных штаммов Staphylococcus sp ., и сопоставить результаты с фенотипическим профилем уроизо-лятов (рис. 3).

■ mecA и blaZ й aac(6')-аph (2'') и ant (4/)-Ia ЕЛ gyrA В ermC

Рис. 3. Генетическая характеристика антибиотикорезистентности выделенных стафилококков mecA – ген устойчивости к метициллину; blaZ – ген устойчивости к ампициллину;

aac(6')-аph (2'') – ген устойчивости к гентамицину; ant(4')-Ia – ген устойчивости к аминогликозидам (тобрамицину, амикацину и канамицину); gyrA , grlA – гены устойчивости к фторхинолонам;

ermA , ermC – гены устойчивости к макролидам

У всех изученных видов стафилококков регистрировали наличие гена mecA , причем у изолятов S. aureus и S. intermedius в 33,3 ± 17,8% случаев, а у штаммов S. sciuri – в 50 ± 20,4% случаев. Ген gyrA , кодирующий устойчивость к фторхинолонам, выявлен только у изолятов S. intermedius , тогда как гены blaZ , aac(6')-аph (2''), ant(4')-Ia , ermC – только у культур S. aureus . Гены аph(3')-IIIa , grlA , ermA , ermB у изученных штаммов не обнаружены.

У 2 изолятов S. aureus зафиксировано сочетание четырех генов ( mecA , blaZ , ant(4')-Ia , ermC ) и пяти генов ( mecA , blaZ , ant(4')-Ia , aac(6')-аph(2'') , ermC ).

Проведенный корреляционный анализ между исследованными признаками на уровне фено- и генотипа не выявил значимых показателей коэффициента корреляции.

Таким образом, полученные результаты показали высокую чувствительность выделенных стафилококков разных видов к ряду изученных антибиотиков: цефазолину, цефепиму, амоксиклаву. Эффективным в отношении коагулазоположительных стафи-

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48) VETERINARY AND ZOOTECHNY лококков оказался также гентамицин, несмотря на то, что изучение резистентности к аминогликозидам на генетическом уровне позволило обнаружить у золотистых стафилококков не только ген aac(6')-аph(2'') , но и ген ant(4')-Ia , который обуславливает устойчивость стафилококков к более широкому спектру аминогликозидных препаратов. На несоответствие между генетическими и фенотипическими паттернами устойчивости к аминогликозидам у изолятов стафилококков указывают L.X. Zhu et al. [10].

Особое значение имеет распространение стафилококков, резистентных к метициллину (или к оксациллину) [11]. Некоторые исследователи приводят данные о наличии резистентности к β-лактамным антибиотикам более чем у 50% клинических изоля-тов коагулазонегативных стафилококков [12], что может быть опосредовано экспрессией гена mecA , кодирующего пенициллинсвязывающий белок 2а (PBP2a или PBP2). Необходимо отметить, что полученные нами данные о чувствительности стафилококков, в частности S. sciuri , к амоксиклаву и ряду цефалоспоринов несколько отличались от результатов, опубликованных в некоторых зарубежных и отечественных источниках [13]. Выявленная нами абсолютная чувствительность к амоксиклаву всех изученных штаммов стафилококков, несущих гены mecA и blaZ , объясняется тем, что клаву-лановая кислота является ингибитором и обладает способностью инактивировать широкий спектр β-лактамаз, обычно обнаруживаемых у микроорганизмов, устойчивых к пенициллинам и цефалоспоринам.

Однако исследование генетических детерминант антибиотикорезистентности выявило наличие гена mecA у 33,3 ± 17,8% изолятов S. aureus и S. intermedius , а также у 50,0 ± 20,4% штаммов S. sciuri , что указывает на устойчивость бактерий ко всем β-лактамным антибиотикам (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы) и непредсказуемую клиническую эффективность [14].

Наряду с геном mecA , способствует приобретению и распространению устойчивости бактерий к пенициллинам ген blaZ , кодирующий β-лактамазу и зарегистрированный нами у культур S. aureus .

В настоящее время стафилококки считаются умеренно чувствительными по отношению к фторхинолонам [15]. В нашем исследовании была оценена активность эн-рофлоксацина и ципрофлоксацина и показано, что по отношению к первому проявляли умеренную резистентность 33,3 ± 17,8% S. aureus и S. intermedius , а по отношению к ципрофлоксацину – все штаммы S. aureus и 33,3 ± 17,8% изолятов S. intermedius. Полученные нами результаты и наличие гена устойчивости gyrA у изолята S. intermedius свидетельствуют о том, что фторхинолоны должны использоваться для терапии пациентов с заболеваниями мочевыделительной системы только после определения чувствительности коагулазоположительных стафилококков к антибиотикам данной группы.

Выявленную нами резистентность стафилококков разных видов к азитромицину подтверждают результаты, полученные [16; 17], которые установили продолжающуюся тенденцию повышения устойчивости к данному препарату, что говорит о необходимости контроля за его применением и постоянного мониторинга резистентности клинических штаммов.

Выводы

У выделенных стафилококков установлена резистентность к азитромицину.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения регионального мониторинга антибиотикорезистентности.

При эмпирической терапии животных с заболеваниями мочевыделительной системы стафилококковой этиологии в качестве препаратов выбора могут использоваться цефазолин, цефепим, амоксиклав, гентамицин.

Vestnik of Omsk SAU, 2022, no. 4(48)