Антифунгальная активность против патогенов зерновых культур и изучение антибиотика штамма Streptomyces sp. К-541, выделенного из экстремальных экосистем Казахстана

В последнее время резко возросло распространение токсиногенных грибов — возбудителей болезней зерновых культур. Грибы, вызывающие фузариозы, пирикуляриозы, альтернариозы и аспергиллезы, приводят к потере более 40 % урожая зерновых (1). Поражая растения, микромицеты наносят значительный экономический ущерб сельскому хозяйству и оказывают вредное воздействие на окружающую среду. Вместе с тем широкое использование химических средств для защиты растений от грибных заболеваний представляет особую опасность, причем негативное влияние фунгицидов со временем возрастает. Ситуация ухудшается из-за развития устойчивости грибов к фунгицидам с последующей необходимостью увеличения дозы применения препаратов. В системах интегрированной защиты растений особое место занимают биометоды, в частности использование микроорганизмов и их вторичных метаболитов для создания эффективных, экологически безопасных фунгицидов с разными механизмами действия, а также для повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам. При этом актуально выявление новых микроорганизмов, образующих соединения с широким спектром биологической активности, для поиска которых представляют интерес различные экосистемы, включая малоизученные экстремальные (2-4).

Актиномицеты — продуценты вторичных метаболитов с антибактериальными, антифунгальными, инсектицидными и другими свойствами (57). Они служат важным компонентом микробоценозов, а их количественный и качественный состав признан фактором, характеризующим экологическое состояние природных экосистем (8). Многие виды актиномицетов, в том числе принадлежащие к роду Streptomyces , известны как антимикотические агенты, которые ингибируют патогенные грибы (9-11). Способность акти-номицетов колонизировать поверхность корней растений, осуществлять биосинтез антибиотиков и внеклеточных ферментов обеспечивает их высокую эффективность в качестве инструментов биоконтроля в системе защиты растений от заболеваний (12-14).

Зерновое хозяйство — основная отрасль растениеводства Казахстана, при этом на засоленные земли в республике приходится 15,2 % от всей площади сельскохозяйственных угодий. Остальные почвы также в разной степени засолены, неоднородны по составу и характеризуются низким содержанием гумуса (15). Разработка биопрепаратов для применения в таких сложных условиях должна основываться на использовании микроорганизмов, сохраняющих биологическую активность в разных экологических нишах. Засоления почвы и рН мешают проявлению защитного и стимулирующего действия микроорганизмов. Актиномицеты, выделенные из экстремальных мест обитания, могут расти и вырабатывать биологически активные вещества при засолении, в щелочной и кислой среде (16, 17). Несмотря на обилие информации о биологических свойствах актиномицетов, их способность регулировать рост патогенных микроорганизмов, в том числе фитопатогенных грибов, в условиях сильной засоленности, высоких и низких значений рН мало изучена (18, 19).

В настоящей работе мы впервые использовали биотехнологический потенциал экстремофильных актиномицетов для разработки антифунгаль-ного биопрепарата с универсальным действием.

Нашей целью было изучение антагонистических свойств штамма Streptomyces sp. К-541 в отношении грибов — возбудителей болезней зерновых культур в разных экологических условиях и групповая идентификация полученного антибиотика.

Методика. Объектом исследований был штамм Streptomyces sp. К541, выделенный в экстремальной экосистеме (соровый солончак, Костанайская обл., Республика Казахстан). Штамм выращивали на трех вариантах глюкозо-дрожжевого агара. Состав питательных сред (г/л) был следу- ющим: среда 1 — глюкоза (2,0), дрожжевой экстракт (1,0), пептон (2,0), агар (20,0), рН 7,2; среда 2 — глюкоза (2,0), дрожжевой экстракт (1,0), пептон (2,0), NaCl (25,0), агар (20,0), рН 7,2; среда 3 — глюкоза (2,0), дрожжевой экстракт (1,0), пептон (2,0), Na2CO3 (2,5), агар (20,0), рН 8,0. Значение рН изменяли 0,1 н. раствора NaOH, используя рН-метр MP220 («Mettler-Toledo International, Inc.», США).

Штамм К-541 рассевали на три варианта агара и культивировали 7 сут при температуре 28 ° C. Антифунгальные свойства определяли методом агаровых блоков (20). Антифунгальную активность штамма, выросшего на нейтральной, засоленной и щелочной среде, оценивали в отношении представителей пяти родов фитопатогенных грибов, которые служат возбудителями основных грибных заболеваний пшеницы и риса: фузариоза — Fusarium solani (Mart.) Sacc., F. oxysporum Schlecht., F . heterosporum Nees, F. sporotrichiella Sherb., пирикуляриоза — Piricularia oryzae Cavara, альтер-нариоза — Alternaria triticina Prasada & Prabhu, A. alternate (Fr.) Keissl., бипо-ляриоза — Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, аспергиллеза — Aspergillus niger van Tieghem. В расплавленную и остуженную до 40-50 ° С среду Чапека-Докса вносили суспензию конидий фитопатогеных грибов (10⁸ КОЕ/мл) из расчета 1 мл на 100 мл среды и разливали в чашки Петри. После культивирования штамма К-541 на трех вариантах глюкозо-дрожжевого агара вырезали блоки растущей культуры буром (диаметр 7 мм), переносили их на чашки Петри, предварительно засеянные тест-культу-рами фитопато-генных грибов, и оставляли на 72 ч при температуре 25 ° С. Контролем служили блоки, вырезанные из чистых агаровых сред. Об антагонистической активности судили по диаметру зоны лизиса тест-культур, которую измеряли с точностью до 1 мм.

Антифунгальные свойства штамма при совместном культивировании с фитопатогенными грибами исследовали на агаре Чапека-Докса (среда А, рН 7,0), при внесении в агар 2,0 % NaCl (среда Б, рН 7,0) и 0,2 % Na₂CO₃ (среда С, рН 8,0). В контрольном варианте фитопатогенные грибы выращивали на агаровых средах индивидуально. Результаты учитывали на 10-е сут культивирования при 25 ° С, измеряя диаметр колоний фитопатогенных грибов в контрольном и опытном вариантах.

Для накопления спорового материала штамм К-541 выращивали в течение 7 сут при температуре 28 ° С на минеральном агаре 1 Гаузе. Готовили инокулюм спор смывом с поверхности растущей культуры (10⁹ КОЕ/мл) и засевали в жидкую питательную среду с овсяной мукой (1 мл инокулюма на 100 мл питательной среды). Состав среды с овсяной мукой (г/л) был следующим: глюкоза (15,0), овсяная мука (15,0), CaCO₃ (2,5), NaCl (5,0), pH 7,0-7,2.

При получении антибиотика штамм К-541 культивировали в колбах Эрленмейера (750 мл) в овсяной среде (объем 100 мл) на круговой качалке (180-200 об/мин) в течение 120 ч при температуре 28 ° С. Биомассу, отжатую до 70 % влажности, взвешивали и экстрагировали 96 % этанолом (из расчета 3 мл этанола на 1 г биомассы). Экстракцию антибиотика А-541 проводили с использованием механической мешалки с верхним приводом RW 20 digital («IKA», Германия) в течение 2 ч при комнатной температуре в вытяжном шкафу, затем в течение 3 ч в холодильнике. Экстракт концентрировали в вакууме на ротационном испарителе RV 10 basic («IKA», Германия) при 35-40 ° С. Из культуральной жидкости антибиотик извлекали экстракцией н-бутанолом (рН 7,0). Экстракт отделяли на делительной воронке, упаривали в вакууме и реэкстрагировали этиловым спиртом.

Этанольные препараты, полученные из культуральной жидкости и биомассы штамма К-541, хроматографировали на пластинах Silufol марок R и UV 254 («Cavalier», Чехия), Sorbfil («Сорбполимер», Россия) и DC-Alu-folien Kieselgel 60 («Merck», США). При выборе оптимальных условий хроматографирования использовали системы растворителей хлороформ—эта-нол (20:1, 20:7), н-бутанол—уксусная кислота—вода (2:1:1, 3:1:1), хлоро-форм—этилацетат (1:1), этанол—бутанол—вода (4:1:1).

Антибиотик обнаруживали на хроматограммах визуально по свечению в УФ-свете (облучатель УФС-254/365, «ЗАО НПО Техноком», Россия) и биоавтографическим методом с использованием в качестве тест-организма Fusarium oxysporum . Зоны, соответствующие положению отдельных компонентов на хроматограмме, вырезали и накладывали на поверхность агара, засеянного тест-организмом. Для накопления компонентов активные зоны с пластинок снимали вместе с основой, элюировали этанолом, фильтровали, экстракт выпаривали до сухого остатка. Спектры поглощения антибиотика в суммарном препарате и его индивидуальных фракциях в УФ и видимой областях измеряли в 96 % этаноле на спектрофотометре Cary 60 UV-Vis («Agilent Technologies», США).

Статистическую обработку результатов проводили согласно описанию В.Ю. Урбах (21). В таблицах приведены средние значения (M ) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Штамм Streptomyces sp. К-541 проявил высокое фунгицидное действие против всех изученных фитопатогенных грибов (табл. 1). Его антибиотическая активность в отношении грибов рода Fusarium составляла 30-45 мм в нейтральных условиях, 40-48 мм — при засолении, 20-33 мм в щелочных условиях; в отношении грибов рода Alternaria — соответственно 32-35, 36-37, 20-22 мм; рода Bipolaris — 36-38, 38-40, 30 мм; рода Piricularia — 40, 56, 50 мм. Следует отметить, что стрептомицеты широко распространены в почвах разных типов, и для кислых почв также описаны виды, способные подавлять развитие фитопатогенных грибов при низких значениях рН (22, 23).

1. Антифунгальные свойства штамма Streptomyces sp. К-541 в отношении возбудителей основных грибных заболеваний пшеницы и риса в зависимости от условий культивирования ( M ±SEM)

Вид гриба	Диаметр зоны подавления роста, мм
	среда 1	среда 2       1	среда 3
Fusarium oxysporum	31±0,3	42±0,2	20±0,2
F. heterosporum	40±0,3	45±0,1	28±0,4
F. solani	45±0,2	48±0,4	33±0,2
F. sporotrichiella	40±0,1	45±0,1	32±0,3
Aspergillus niger	46±0,3	50±0,3	30±0,4
Piricularia oryzae	40±0,5	56±0,1	50±0,6
Alternaria alternata	32±0,3	36±0,4	20±0,1
A. triticina	35±0,3	37±0,2	22±0,3
Bipolaris sorokiniana	38±0,1	40±0,5	30±0,6
Контроль (без тест-культуры)	0	0	0

П р и м е ч а н и е. Состав использованных для культивирования вариантов глюкозо-дрожжевого агара (среды 1-3) см. в разделе «Методика».

Для выявления возможности интродукции в почвенные биоценозы экстремофильного стрептомицета К-541 как агента биоконтроля грибных инфекций было проведено совместное культивирование этого штамма и фитопатогенных грибов на агаровой среде Чапека-Докса (табл. 2, рис.). При таком культивировании наблюдалось значительное ингибирование роста грибов: диаметр колоний Fusarium oxysporum уменьшался в 2,2-2,1 раза, Piricularia oryzae — в 1,8-2,7 раза, Alternaria alternata — в 2,2-2,4 раза, Bipolaris sorokiniana — в 2,0-2,2 раза, Aspergillus niger — 2,4-2,5 раза. Пока-99

зана высокая степень ингибирования роста фитопатогенных грибов не только на исходной среде, но также в условиях засоления (2,0 % NaCl, среда Б) и при щелочном значении pH (0,2 % Na2CO3, среда С).

2. Антифунгальное действие штамма Streptomyces sp. К-541 на фитопатогенные грибы — возбудители заболеваний пшеницы и риса при совместном культивировании ( M ±SEM)

Вид гриба        Вариант

Диаметр колоний, мм среда А         среда Б          среда С

Fusarium oxysporum      Контроль Опыт Piricularia oryzae         Контроль Опыт Alternaria alternata        Контроль Опыт Bipolaris sorokiniana      Контроль Опыт Aspergillus niger           Контроль Опыт

116±0,3            112±0,2             100±0,2 52±0,1             50±0,3              48±0,2 64±0,2            66±0,3             60±0,3 36±0,1             30±0,1              22±0,1 88±0,4             88±0,5              86±0,3 40±0,2            38±0,2             36±0,2 48±0,1            44±0,4             42±0,4 22±0,3             22±0,1              20±0,1 114±0,3            114±0,2             112±0,5 48±0,5            46±0,1             44±0,3

Прим еч ани е. Среда А — агар Чапека-Докса; среда Б — агар Чапека-Докса + 2 % NaCl; cреда С — агар Чапека-Докса + 0,2 % Na2CO3, рН 8,0.

Ингибирование роста у Fusarium ox-ysporum при совместном культивировании со штаммом Streptomyces sp. К-541: слева — контроль, справа — опыт (10-е сут роста; среда Чапека-Докса, 2 % NaCl, рН 7,0).

Тонкослойная хроматография показала, что антибиотик А-541 представляет собой комплексный препарат. Была установлена иден- тичность состава компонен- тов препаратов, полученных из культуральной жидкости (А-541-1) и из биомассы (А-541-2). Наилучшее разделение на компоненты наблюдалось при использовании системы н-бу-танол—уксусная кислота—вода (3:1:1), которая позволила обнаружить 8 индивидуальных химических соединений; все компоненты показали свечение в УФ-свете. Далее эту систему применили для препаративного выделения антибиотически активных фракций на пластинах с закрепленным слоем силикагеля.

Методом биоавтографии с использованием Fusarium oxysporum в качестве тест-организма было установлено, что биологической активностью обладает только один компонент (IV компонент) с Rf в системе н-бута-нол—уксусная кислота—вода (3:1:1) соответственно 0,52 (антибиотик А-541-1) и 0,46 (антибиотик А-541-2). При тонкослойной хроматографией в системе н-бутанол—уксусная кислота—вода (2:1:1, 3:1:1) IV компонент, имеющий биологическую активность, проявлял себя как однородное вещество. Активный компонент выделяли для антибиотического препарата А-541-2 из зоны с Rf = 0,46. Спектры поглощения комплексного антибиотика А-541 и IV компонента были идентичны и имели основные максимумы в УФ-области при λ 317, 330, 354 и 376 нм. В ультрафиолетовом спектре присутствовали максимумы, характерные для полиеновых антибиотиков, наиболее близкие к таковым у представителей подгруппы гекса-енов (при λ 330, 354, 376 нм) (24).

Таким образом, штамм Streptomyces sp. К-541 может рассматривать- ся как перспективный агент против вредоносных грибных инфекций зерновых культур (пшеницы и риса) благодаря высокой антифунгальной активности в отношении всех изученных фитопатогенов. Показана возможность его использования для интродукции в почвенные биоценозы для биоконтроля возбудителей фузариозов зерновых культур в разных экологических условиях (нейтральных, щелочных и при засолении). Это свойство особенно ценно для растениеводства Казахстана, где почвенный покров неоднороден по составу и характеризуется высоким засолением. Выделенный антибиотик А-541 предварительно отнесен к группе полиенов, сделан вывод о его принадлежности к антибиотикам гексаенового типа.