Антигенные взаимосвязи и биологические свойства штаммов вируса свиного гриппа A/H1N1, выделенных в Северном Казахстане в 2018 году

Вирусы гриппа рода А — уникальные инфекционные агенты человека, а также ряда млекопитающих и птиц (1, 2). Вопрос межвидовой трансмиссии вирусов гриппа А(Н1N1) человека и животных важен для изучения эволюции, экологии и эпидемиологии возбудителя. Существуют теоретические обоснования возможности передачи вируса гриппа А между птицами околоводного комплекса и другими морскими обитателями, птицами и свиньями, тюленями и людьми, свиньями и людьми (3, 4).

Часто у свиней, зараженных вирусом гриппа, клинические признаки заболевания не проявляются, а смертность не превышает 1-4 %. В условиях умеренного климата животные могут быть инфицированы вирусом гриппа круглый год, но в холодное время вероятность заражения повышается (5).

Вирус гриппа свиней обнаружен во многих странах с развитым животноводством, в том числе в Казахстане (6-9). В настоящее время в популяциях свиней выявлены три подтипа вируса гриппа А: H1N1, H3N2, H1N2. Антигенно отличающийся вариант H1N1 птичьего происхождения у свиней выделяют с 1979 года. Наиболее распространен A/H1N1, антитела к которому выявлены у свиней во всех странах мира (10). Штаммы вируса гриппа с антигенной формулой A/H3N2, ставшие результатом межвидовой трансмиссии вируса от человека к свиньям, впервые обнаружены в 1970 году. Штаммы A/H1N2, выделенные от свиней в 1994 году как результат реассортации вирусов гриппа свиней, человека и птиц, продолжают циркулировать и по настоящее время (11).

Свиньи заражаются вирусами гриппа человека и птиц. При одновременном заражении этими двумя вирусами происходит обмен наследственным материалом между штаммами различного происхождения, в результате вновь появившиеся вирионы приобретают способность передаваться от человека к человеку с вероятностью развития пандемии (12).

Постоянный мониторинг распространения возбудителя инфекции, расшифровка этиологии заболевания, всесторонняя характеристика инфекционного агента играют важную роль в разработке и планировании мероприятий по предотвращению возможной эпизоотии. Определение биологических и антигенных особенностей циркулирующих вирусов позволяет выявить главные направления изменчивости, филогенетические взаимосвязи штаммов, обнаруженных ранее и постоянно появляющихся в различных странах и регионах. Сведения об эпидемически актуальных штаммах дают возможность понять истоки текущих и будущих эпидемий и наиболее точно подобрать средства и способы профилактики гриппа, а также стратегию лечения.

В представляемой работе при изучении биологических свойств штаммов вируса гриппа A/H1N1, выделенных в популяции свиней в Северном Казахстане, мы впервые установили более высокую степень сходства этих штаммов с классическими вариантами вируса гриппа свиней A/H1N1 (A/Swine/USA/1976/31 и A/swine/Iowa/15/30), чем с циркулирующими в настоящее время в человеческой популяции штаммами, родственными штамму А/California/04/09 pdm. Кроме того, обнаружена чувствительность изолированных штаммов к противогриппозным препаратам адамантанового ряда (ремантадин) и ингибиторам нейраминидазы (тамифлю), а также резистентность к арбидолу и ингавирину.

Нашей целью было выявление биологических и антигенных особенностей штаммов вируса гриппа свиней А/Н1N1, циркулировавших в Северо-Казахстанской области Республики Казахстан в 2018 году.

Методика . В исследованиях использовали штаммы вируса гриппа

А/Н1N1, выделенные из проб, собранных в 2018 году в свиноводческих хозяйствах Северо-Казахстанской области (А/свинья/Петропавловск/01/18, А/свинья/Петропавловск/02/18 и А/свинья/Петропавловск/03/18), а также референсные штаммы — A/Swine/Iowa/15/30, A/swine/USA/1976/31 и A/California/04/09 pdm (коллекция лаборатории биохимии вирусов, ТОО Научно-производственный центр «Микробиологии и вирусологии»). Клонирование вирусов осуществляли в системе 10-суточных развивающихся куриных эмбрионов (КЭ) с инокуляцией вирусного материала в хорионаллантоисную полость. Собранную аллантоисную жидкость центрифугировали при 24000 об/мин в течение 180 мин при +4 °С. Дальнейшую очистку и концентрирование вирусного материала проводили в градиенте плотности сахарозы на центрифуге Beckman («Beckman Coulter», США; ротор Ti 45, 37000 об/мин, 90 мин, +4 °С) (13).

Антигенные свойства поверхностных гликопротеидов штаммов исследовали в перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с рекомендациями Всемирной организации зравоохранения (14) с использованием кроличьих иммунных сывороток (15). Специфические гипериммунные кроличьи сыворотки получали 3-кратной иммунизацией кроликов породы шиншилла массой 2,5-3 кг. Концентрированный вирус вводили подкожно в дозе 150 мкг/животное с интервалом 21 сут. Специфическую активность полученных гипериммунных кроличьих сывороток определяли в РТГА с набором антигенов для диагностики вирусов гриппа (ООО «ППДП», г. Санкт-Петербург, Россия) с антигенными формулами A/H1N1, A/H3N2 и типа В.

Инфекционность выделенных штаммов определяли на 10-суточных КЭ и в культуре клеток MDCK (Madin-Darby canine kidney, перевиваемая культура клеток эпителия почки собаки, АТСС Catalogue of cell lines & hybridomas, 7^th edn. Rockville, MD, 1992) по методу L. Reed и H. Muench (16) на основании оценки эмбриональной инфекционной дозы и тканевой цитопатогенной дозы и выражали соответственно в lg ЭИД₅₀/0,2 мл и lg ТЦД 50 /0,2 мл.

Адсорбционные свойства штаммов изучали при 4 °С в течение 18 ч на 50 % формалинизированных куриных эритроцитах при постоянном помешивании. Формалинизированные эритроциты кур получали обработкой предварительно отмытых эритроцитов кур 40 % раствором формальдегида в пропорции 1:1. После контакта эритроцитов с формалином в течение 6 сут при периодическом ресуспендировании формалин удаляли многократным отмыванием стерильным физиологическим раствором с последующим центрифугированием при 3000 об/мин (Rotanta 460, «Hettich», Германия). Элюцию с эритроцитов учитывали при 37 °С в забуферном физиологическом растворе через 30, 60, 120, 180 и 240 мин. Термочувствительность гемагглютинина (ГA) оценивали по способности вирусов агглютинировать эритроциты после прогревания при 56 °С в течение 5, 10, 15, 30 и 60 мин (17). Гемагглютинирующую активность штаммов устанавливали с 0,75 % суспензиями эритроцитов курицы, морской свинки, барана, лошади и человека с I(0) группой крови в реакции гемагглютинации (РГА) (18). Эритроциты трижды отмывали в стерильном забуференном физиологическом растворе осаждением в течение 10 мин при 1500 об/мин (CM-6M, «Elmi», Латвия). Из осадка отмытых эритроцитов готовили 0,75 % суспензию.

Чувствительность изолятов к неспецифическим ингибиторам определяли в РТГА с полученными нативными и прогретыми (30 мин при 62 °С и 10 мин при 100 °С) сыворотками крови морской свинки, курицы и кролика.

Чувствительность выделенных штаммов к различным концентрациям противовирусных препаратов оценивали по степени подавления репродукции 100 ЭИД50/0,2 мл вируса на КЭ. Для изучения чувствительности использовали лекарственные средства ремантадин (100 мг/капсула, АО «Olainfarm», Латвия), тамифлю (75 мг/капсула, «Cenexi SAS», Франция, упаковано «F. Hoffmann-La Roche AG», Швейцария), арбидол (100 мг/капсу-ла умифеновира гидрохлорида моногидрата в пересчете на умифеновира гидрохлорид, ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия); ингавирин (90 мг/капсула имидазолилэтанамида пентандиовой кислоты — витаглута-ма, ОАО «Валента Фармацевтика», Россия). Препараты растворяли в фосфатно-буферном растворе в концентрации 50 мг/мл, полученные растворы использовали в качестве исходных. Дозу препарата, подавляющую титр вируса в РГА в 2 раза по сравнению с контролем, считали ингибирующей концентрацией (ИК50) (19).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010. Для всех серий результатов находили средние геометрические обратных логарифмов титров гемагглютинации по основанию 2 (geometric mean titer, GMT) и определяли их стандартные отклонения (±SD).

Результаты . Для изучения антигенных взаимосвязей выделенных штаммов вирусный материал, накопленный в КЭ, после очистки концентрировали в фосфатно-буферном растворе в объеме 2,0-2,7 мл. Содержание белка в этих образцах составляло 0,336-0,683 мг/мл, гемагглю-тинирующая активность — 256000-512000 ГАЕ/мл. При иммунизации кроликов очищенными вируссодержащими суспензиями в дозе (по белку) 150 мкг/животное получили гипериммунные поликлональные сыворотки. Для дальнейшей работы сыворотки разводили в концентрации 1:10 и прогревали согласно стандартной процедуре при 56 °С в течение 30 мин для инактивации термолабильных белков системы комплемента. Титры специфических антител полученных сывороток в РТГА с гомологичными штаммами составили 1:320 и 1:5120.

Иммунные кроличьи сыворотки, полученные к казахстанским штаммам вируса гриппа свиней, в титрах 1:160 подавляли гемагглютинирующую активность диагностикума (вирус гриппа A/H1N1). С гетерологичными вирусами A/H3N2 и типа B сыворотки не взаимодействовали.

1. Результаты перекрестной реакции торможения гемагглютинаци (РТГА) референсных штаммов вируса гриппа свиней А(Н1N1) и изолятов, выделенных в свиноводческих хозяйствах Северного Казахстана в 2018 году

Изолят, штамм	Антисыворотка к вирусам гриппа
	1	2	3	4	5	6
A/свинья/Петропавловск/01/18	320	160	2560	1280	320	40
A/свинья/Петропавловск/02/18	160	320	2560	1280	160	40
A/свинья/Петропавловск/03/18	160	160	2560	1280	160	40
A/swine/USA/1976/31	80	160	1280	640	640	20
A/swine/Iowa/15/30	320	80	2560	640	640	40
A/California/04/09 pdm	20	40	20	20	40	160
Прим еч ани е. Представлены обратные значения титров			антигемагглютининов. 1		— A/свинья/Петро-
павловск/01/18, 2 — A/свинья/Петропавловск/02/18,		3 —	A/свинья/Петропавловск/03/18, 4			— А/swi-
ne/USA/1976/31, 5 — A/swine/Iowa/15/30	, 6 — А/California/04/09 pdm.

Выделенные штаммы А/свинья/Петропавловск/01/18, А/свинья/Пет-ропавловск/02/18 и А/свинья/Петропавловск/03/18 взаимодействовали с иммунными сыворотками к эталонным вирусам A/swine/USA/1976/31(H1N1) и A/swine/Iowa/15/30 (H1N1) в высоких титрах (табл. 1). С антисывороткой к дрейф-варианту А/California/04/09 (Н1N1) pdm они реагировали в более низких титрах. По антигенной структуре гемагглютинина изучаемые штаммы существенно не различались между собой. Так, было выявлено антигенное родство вариантов вируса гриппа А(Н1N1), выделенных от свиней, между собой и с референсными штаммами A/H1N1 (A/swine/USA/1976/31 и A/swine/Iowa/15/30), а также их отличие от штамма А/California/04/09 pdm.

Инфекционная активность выделенных штаммов вируса гриппа свиней на КЭ варьировала в пределах 6,5-7,9 lg ЭИД50/0,2 мл, на культуре клеток MDCK — 3,5-4,3 lg ТЦД50/0,2 мл. По этому признаку они несколько уступали эталонным штаммам A/swine/Iowa/15/30 и A/swine/USA/1976/31 с показателями, составившими соответственно 8,7 и 8,0 lg ЭИД50/0,2 мл и 5,2 и 5,1 lg ТЦД50/0,2 мл (табл. 2). Штамм А/свинья/Петропавловск/01/18 по инфекционной активности оказался близок к эталонному штамму A/California/04/09 pdm.

По термочувствительности гемагглютинина тестируемые изоляты вируса гриппа свиней, аналогично референсным штаммам, были отнесены к термостабильным вариантам, поскольку сохраняли способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы в высоких титрах (log2 от 6,3±0,6 до 9,6±0,8) после прогревания при 56 °С в течение 60 мин (см. табл. 2). Установлено, что все изученные штаммы обладали хорошей адсорбирующей способностью по отношению к эритроцитам кур (90-100 %); их элюция происходила в течение 30-60 мин инкубации при 37 °С.

2. Основные биологические свойства изолятов вируса гриппа свиней А/Н1N1, выделенных в свиноводческих хозяйствах Северного Казахстана в 2018 году

Изолят, штамм	ИА		ТГ		Ад	Эл
	1	2	3	4

А/свинья/Петропавловск 01/18 6,5 3,5 9,7±0,2 9,6±0,8 90 1,0 А/свинья/Петропавловск 02/18 7,8 4,3 9,6±0,4 9,6±0,8 100 1,0 А/свинья/Петропавловск 03/18 7,9 4,3 9,7±0,6 9,3±0,9 100 0,5 A/swine/Iowa/15/30 8,8 5,2 9,7±0,6 6,3±0,6 100 1,0 A/swine/USA/1976/31 8,0 5,2 8,7±0,6 6,6±0,6 90 0,5 A/California/04/09 pdm 6,0 3,8 8,7±0,6 6,6±0,6 100 1,0 П р и м е ч а н и е. ИА — инфекционная активность: 1 — для куриных эмбрионов, lg ЭИД50/0,2 мл, 2 — для культуры клеток MDCK, lg ТЦД50/0,2 мл; ТГ — термостабильность гемагглютинина (GMT±SD): 3 — исходный вирусный препарат, 4 — препарат после прогревания при 56 °С в течение 60 мин; Ад — ад сорбция на куриных эритроцитах, %; Эл — время элюции с куриных эритроцитов при 37 °С, ч.

Выделенные штаммы вируса гриппа свиней, как и референсные варианты A/swine/Iowa/15/30 и A/swine/USA/1976/31, в высоких титрах активно агглютинировали все виды эритроцитов в эксперименте (табл. 3).

3. Гемагглютинирующая активность референсных штаммов вируса гриппа свиней А(Н1N1) и изолятов, выделенных в свиноводческих хозяйствах Северного Казахстана в 2018 году, по отношению к эритроцитам человека и различных животных (GMT±SD)

Изолят, штамм	Курица	Морская свинка	Баран	Лошадь	Человек, группа крови I(0)
А/свинья/Петропавловск 01/18	9,5±0,4	10,1±0,2	10,0±0,0	9,6±0,4	10,4±0,2
А/свинья/Петропавловск 02/18	9,6±0,3	10,5±0,4	10,0±0,0	9,7±0,2	10,4±0,2
А/свинья/Петропавловск 03/18	9,5±0,4	10,5±0,4	10,0±0,0	9,5±0,4	10,3±0,0
A/swine/Iowa/15/30	9,7±0,6	12,0±0,0	9,5±1,4	8,7±0,3	9,6±1,5
A/swine/USA/1976/31	8,7±0,6	11,0±0,0	8,2±1,6	9,7±0,4	9,3±1,2
A/California/04/09 pdm	8,7±0,6	9,3±0,6	6,6±0,6	1,0±0,0	8,0±0,0

П р и м е ч а н и е. Представлены среднегеометрические логарифмы (GMT) с основанием 2 для обратных титров гемагглютининов.

У всех тестируемых изолятов гемагглютинирующая активность не подавлялась неспецифическими нативными сыворотками взятых в эксперимент животных (табл. 4). Однако прогревание сывороток способствовало повышению их ингибирующей активности. Титры ингибиторов возрас- тали в сыворотках, прогретых 30 мин при температуре 62 °С, и еще более — при кипячении в течение 10 мин при 100 °С.

4. Чувствительность изолятов вируса гриппа свиней А/Н1N1, выделенных в свиноводческих хозяйствах Северного Казахстана в 2018 году, к неспецифическим ингибиторам сывороток крови различных животных

Изолят, штамм Сыворотка крови морская свинка курица кролик 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A/свинья/Петропавловск/01/18 < 20 20 160 < 20 40 80 < 20 20 20 A/свинья/Петропавловск/02/18 < 20 40 80 < 20 80 80 < 20 80 160 A/свинья/Петропавловск/03/18 < 20 40 80 < 20 160 160 < 20 80 160 A/swine/Iowa/15/30 < 20 40 80 < 20 < 20 40 < 20 80 160 A/swine/USA/1976/31 < 20 80 80 < 20 < 20 40 < 20 40 160 A/California/04/09 pdm < 20 40 80 < 20 < 20 40 < 20 80 80 Прим еч ани е. 1 — нативные сыворотки, 2 — прогревание 30 мин при 62 °С 3 — кипячение 10 мин при 100 °С. Представлены обратные величины титров неспецифических ингибиторов.

Предварительное изучение на КЭ не выявило эмбриотоксического действия взятых в эксперимент противовирусных препаратов во всех изученных дозах (20, 21).

Исследуемые изоляты вируса гриппа свиней А/Н1N1, как и референсные штаммы, оказались чувствительными к тамифлю и ремантадину (табл. 5). Ингибирующая концентрация для них составила соответственно 5,6-6,6 и 3,7-12,7 мкг/мл. При этом изоляты, как и эталонные варианты, оказались резистентными к арбидолу и ингавирину, которые не ингибировали репродукцию вирусов даже в высокой концентрации (50 мкг/мл).

5. Чувствительность изолятов вируса гриппа свиней А/Н1N1, выделенных в свиноводческих хозяйствах Северного Казахстана в 2018 году, к противовирусным препаратам (GMT±SD)

Изолят, штамм	Ингибирующая концентрация, мкг/мл
	тамифлю	ремантадин	арбидол	ингавирин
A/свинья/Петропавловск/01/18	6,6±0,1	6,9±0,0	Не ингибирует	Не ингибирует
A/свинья/Петропавловск/02/18	5,6±2,0	12,7±0,1	Не ингибирует	Не ингибирует
A/свинья/Петропавловск/03/18	5,7±1,7	3,7±0,2	Не ингибирует	Не ингибирует
A/swine/Iowa/15/30	6,5±0,1	6,7±0,2	Не ингибирует	Не ингибирует
A/swine/USA/1976/31	6,6±0,6	7,0±0,1	Не ингибирует	Не ингибирует
A/California/04/09 pdm	3,5±0,0	Не ингибирует	Не ингибирует	Не ингибирует

П р и м еч а ни е. Указана концентрация препарата, вызывающая снижение репродукции вируса в куриных эмбрионах в 2 раза.

Суммируя полученные данные, отметим, что сравнение биологических свойств вирусов гриппа свиней, изолированных на территории Республики Казахстана в 2018 году, и штаммов, выделенных в 2010-2016 годах (9, 22), показало, что по основным биологическим свойствам они представляют собой в основном однородную группу. Изоляты проявляли незначительную антигенную гетерогенность, что свидетельствуют о продолжительной циркуляции антигенно однородных штаммов вирусов гриппа среди свиней, и большее сходство эталонными вариантами вируса гриппа свиней (A/swine/USA/1976/31 и A/swine/Iowa/15/30), чем с циркулирующими в популяции людей после 2009 года штаммами вируса гриппа А/H1N1, родственными A/California/04/09 pdm. Восприимчивость к вирусам гриппа А птиц и человека, выявляемая у свиней, позволяет считать их промежуточным хозяином, в организме которого происходит реассортация между генами вирусов гриппа различного происхождения. Этот процесс может приводить к возникновению новых антигенных вариантов вируса гриппа с эпидемическим потенциалом (23). Степень патогенности и эпидемической активности неодинакова для различных вариантов вируса гриппа и зависит как от молекулярно-биологических свойств штаммов, так и от особенностей их экологии. При сравнении штаммов вируса гриппа в перекрестной РТГА определяется характер их серологических отношений, которые могут отражать небольшие антигенные различия по гемагглютинину между сходными штаммами и/или указывать на различия между группами штаммов (24, 25).

Таким образом, штаммы вируса гриппа свиней, выделенные из проб, собранных от животных в Северном Казахстане в 2018 году, по антигенной формуле были сходны между собой и со штаммами, циркулировавшими ранее в популяции свиней на территории Республики Казахстан, а также с классическими эталонами вируса гриппа свиней, но отличались от штаммов, циркулирующих в человеческой популяции. Изоляты, выделенные в 2018 году, были сходны друг с другом и с референсными штаммами по термостабильности гемагглютинина и скорости адсорбции на куриных эритроцитах, но различались по скорости элюции с эритроцитов, чувствительности к противовирусным препаратам, а также по инфекционной активности. Два штамма вируса гриппа свиней — А/свинья Петропав-ловск/02/18 и А/свинья Петропавловск/03/18 по инфекционности были близки к эталонным штаммам A/swine/Iowa/15/30 и A/swine/USA/1976/31, тогда как штамм А/свинья/Петропавловск/01/18 по этому признаку проявил сходство с эталонным вариантом A/California/04/09 pdm. Выявлена чувствительность изолятов к противовирусным препаратам тамифлю и ремантадину и резистентность к арбидолу и ингавирину. Изучение антигенных и биологических свойств вирусов гриппа животных позволяют установить закономерности циркуляции патогена и развития инфекционного процесса, составить прогноз эпидемической ситуации и выбрать адекватную стратегию и тактику проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий. При этом крайне актуально выявление вновь возникающих вариантов вируса в популяциях восприимчивых к гриппу видов животных, в особенности свиней, в связи с чем мы планируем продолжить мониторинговые исследования.