Антимикробная активность экстрактов очитков (Sedum maximum (L.) Hoffm., Sedum telephium L), полученных разными методами

стью. Спектр антимикробных средств, применяемых для борьбы с патогенными микроорганизмами, в связи с развившейся проблемой антибиотикоре-зистентности, неуклонно сужается, что служит дополнительным стимулом поиска новых средств с отличающимся от широко применяемых препаратов химиотерапии механизмом действия. Результаты ис- следований последних лет свидетельствуют о том, что средства растительного происхождения являются весьма перспективными для применения в этой области и уже хорошо себя зарекомендовали [1].

Использование лекарственных растений в терапии многих заболеваний, нередко вялотекущих, как в комплексе с другими препаратами и методами, так и при индивидуальном применении, позволяет эффективно бороться с болезнью, при этом не влечет за собой большого количества нежелательных побочных эффектов [1–3].

Исследования антимикробной и ранозаживляющей активности лекарственного растительного сырья (ЛРС) растений рода Очиток, начатые ранее, показали, что водные растворы спиртовых экстрактов обладают антибактериальным действием [4–7]. При получении экстрактов для данных исследований использовался режим экстракции при температуре 90°С. Согласно имеющимся данным, основными действующими веществами исследуемых видов очитков являются флавоноиды [8], которые частично разрушаются при температурной обработке. В связи с этим была выдвинута гипотеза, что более низкая температура экстракции позволит сохранить от разрушения больше действующих веществ в составе композиции. Следовательно, представляет научный интерес как сравнение антибактериальной активности нового извлечения с результатами предыдущих экспериментов, так и изучение возможного противогрибкового эффекта экстрактов.

Цель: провести изучение антимикробной (антибактериальной и антимикотической) активности водных растворов спиртовых экстрактов очитка пурпурного и очитка большого, полученных при низкотемпературной экстракции.

Материал и методы. Объектом исследования послужили два вида флавоноидсодержащих растений из семейства Толстянковых: очиток большой ( S. maximum (L.) Hoffm.) и очиток пурпурный ( S. telephium L.). Основными действующими веществами указанных видов являются флавоноиды (кемпферол, мирицетин, изорамнетин, кверцетин, кемпферитин) и их гликозидные производные; органические кислоты: щавелевая, лимонная, яблочная, пальмитиновая, α-линоленовая, линолевая, янтарная, фумаровая, аскорбиновая; углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, седогептулоза); кумарины (кумарин, эскулетин), алкалоиды (сединин, седамин, никотин); эфирные масла. Кроме того, в траве очитка большого присутствуют дубильные вещества, каротиноиды, полифенолы и другие вещества [8, 9]. Стоит отметить, что основная масса действующих веществ находится именно в надземной части растения: фенольные соединения в большинстве своем содержатся в цветках, полисахариды и органические кислоты в листьях [9].

Для проведения исследований ЛРС очитка пурпурного и очитка большого была использована трава, собранная в августе 2015 г. в период цветения на территории Балашовского района Саратовской области.

Извлечения из травы очитка пурпурного и очитка большого получены методом двукратной спиртовой экстракции. Для определения количественного содержания флавоноидов и исследования антимикробной активности получали спиртовые экстракты, очищенные и не очищенные хлороформом, из травы очитка пурпурного и очитка большого. Выделение флавоноидов из сырья проводилось по модифици- рованной методике Н. В. Машурчака [10], которая ранее применялась для получения сухого экстракта из других видов ЛРС, обладающих биологической активностью. Необходимая модификация обусловлена специфическими особенностями сырья очитков: оно было зафиксировано в этаноле для предотвращения ферментативного разрушения флавоноидов, неизбежного при сушке суккулентов.

Навеску сырья массой 20 г измельчали в ступке, помещали коническую колбу и добавляли 40 мл 95%-ного этилового спирта. Колбу нагревали 45 мин на водяной бане при 55°С, затем фильтровали через бумажный складчатый фильтр в отдельную колбу. Далее проводили повторную экстракцию из этого сырья при тех же условиях. Полученные после обоих этапов экстракции извлечения объединяли, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали для удаления восков и мелкодисперсных примесей. Готовый экстракт представляет собой прозрачное извлечение темно-желтого цвета с характерным запахом этилового спирта. Затем экстракты выпаривали на теплой водяной бане, сухой остаток растворяли в нагретой до 40°С воде. После этого к части экстрактов добавляли по 2 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение минуты, центрифугировали в течение 5–10 мин и отбирали водную фракцию, которую затем использовали в эксперименте. Прочие извлечения использовали без обработки хлороформом. Для приготовления матричных растворов экстракты упаривали на водяной бане при 50°С, полученный сухой остаток взвешивали и разбавляли дистиллированной водой из расчета 100 мг экстрактивных веществ на 1 мл воды.

Антимикробную активность водных растворов спиртовых экстрактов определяли в отношении стандартных штаммов: Staphylococcus aureus ATCC 6538Р, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 13108, взятых из музея живых культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России.

Антибактериальная активность экстрактов изучалась методом серийных двукратных разведений экстрактов в среде Мюллеpа — Хинтона с концентрациями сухого экстракта от 50 до 3,13 мг/мл. Антигрибковая активность спиртовых экстрактов исследовалась в среде Сабуро при тех же разведениях.

Из суточных культур исследуемых штаммов (в случае исследования противогрибковой активности культуру выращивали двое суток) готовили взвеси с использованием стандарта мутности McFаrland 10 ME, доводя конечную концентрацию микроорганизмов до 2·106 КОЕ/мл. В каждую пробирку с рабочим разведением экстракта вносили по 0,1 мл такой микробной взвеси. В контрольные пробирки помещалась взвесь микроорганизмов с питательной средой без экстракта. Смесь инкубировали в термостате в течение 24 ч (в случае изучения антигрибковой активности — 48 ч). Далее, отмечая последнюю пробирку с выраженной задержкой роста, производили учет результатов опыта. Количество исследуемого вещества в этой пробирке расценивалось как минимальная подавляющая концентрация (МПК).

Для оценки характера антимикробного действия производили высев на плотные питательные среды из опытных пробирок. Чашки помещали в термостат на сутки (в случае изучения антигрибковой активности на 48 ч). Через соответствующие промежутки

Таблица 1

Антимикробная активность (МПК мг/мл) водных растворов четырех видов спиртовых экстрактов очитков, полученных по новой низкотемпературной методике

Тип экстракта	E. coli	S. aureus	P. aeruginosa	C. albicans
Водный раствор спиртового экстракта очитка большого (экстракт №1)	12,5	3,13	25	—
Водный раствор спиртового экстракта очитка большого, очищенный хлороформом (экстракт №2)	12,5	3,13	6,25	—
Водный раствор спиртового экстракта очитка пурпурного (экстракт №3)	50	6,25	25	—
Водный раствор спиртового экстракта очитка пурпурного, очищенный хлороформом (экстракт №4)	50	3,13	25	—

Таблица 2

Сравнительный анализ антибактериальной активности (МПК мг/мл) водных растворов четырех видов спиртовых экстрактов очитков, полученных по ранее использовавшейся и новой низкотемпературной методикам

Тип экстракта Тип методики E. coli S. aureus P. aeruginosa Экстракт №1 Методика 1 50 12,5 25 Методика 2 12,5 3,13 25 Экстракт №2 Методика 1 50 6,25 3,13 Методика 2 12,5 3,13 6,25 Экстракт №3 Методика 1 25 25 25 Методика 2 50 6,25 25 Экстракт №4 Методика 1 25 6,25 6,25 Методика 2 50 3,13 25 времени производили подсчет количества выросших колоний в сравнении с контрольным высевом и делали вывод о бактериостатическом или бактерицидном характере действия экстрактов очитков на микроорганизмы.

Результаты. В отношении E. coli антимикробное действие очитка большого (МПК 12,5 мг/мл) и очитка пурпурного (МПК 50 мг/мл) было незначительным. При этом МПК очищенных хлороформом экстрактов соответствовала таковой неочищенных экстрактов. Таким образом, очистка хлороформом на антибактериальную активность в отношении данного штамма не повлияла. Антимикробная активность экстрактов очитка большого и пурпурного в отношении S. aureus была более выражена. Диапазон МПК составил от 6,25 до 3,13 мг/мл, причем экстракт очитка пурпурного, очищенный хлороформом, продемонстрировал более высокую противостафилококковую активность, чем соответствующий экстракт без очистки (МПК 3,3 и 6,25 мг/мл соответственно). В отношении синегнойной палочки выраженную антимикробную активность продемонстрировал только экстракт очитка пурпурного, очищенного хлороформом: МПК составила 6,25 мг/мл. Его активность существенно превышала таковую неочищенного экстракта (25 мг/мл) (табл. 1).

Антимикотическая активность исследованных экстрактов не установлена (рост отмечался даже при максимальной концентрации экстрактов).

При учете характера действия исследуемых экстрактов получены следующие результаты: в отношении стафилококков экстракты обладали бактерицидным действием даже при МПК. В отношении кишечной палочки эффект носил бактериостатический характер. В отношении синегнойной палочки характер действия зависел от концентрации: МПК оказывала бактериостатический эффект, а более высокие концентрации — бактерицидный.

Результаты сравнительного анализа антибактериального действия экстрактов, полученных по использовавшейся ранее (методика 1) и по вновь предложенной низкотемпературной методике (методика 2), представлены в табл. 2.

Обсуждение . В ходе исследования установлена антибактериальная активность спиртовых экстрактов очитка большого и очитка пурпурного, полученных путем низкотемпературной экстракции, в отношении всех тест-культур, за исключением грибов рода Candida. Водные растворы спиртового экстракта очитка большого обладают более выраженной антимикробной активностью, чем аналогичные экстракты очитка пурпурного. Антибактериальная активность водных растворов спиртовых экстрактов обоих видов очитков, очищенных хлороформом, была выше, чем неочищенных.

Из представленных в табл. 2 результатов сравнительного анализа двух методик экстракции видно, что полученные по низкотемпературной методике извлечения из очитка большого, очищенные и не очищенные хлороформом, обладали более высокой антимикробной активностью в отношении E. coli и S. aureus , чем извлечения, полученные по применявшейся ранее методике. В то же время их противоси-негнойная активность не зависела от температурного фактора экстракции. Изменение способа экстракции повысило противостафилококковую активность извлечений очитка пурпурного, но несколько снизило антимикробную активность в отношении грамотрица-тельных бактерий.

Заключение. Спиртовые экстракты очитка большого и очитка пурпурного обладают антибактериальной активностью в отношении как грамположи- тельного (S. aureus), так и грамотрицательных (E. coli, P. aeruginosa) микроорганизмов и не обладают противогрибковой активностью.

При сравнении антимикробной активности двух групп экстрактов, полученных по разным методикам, наблюдается более выраженное действие низкотемпературных извлечений в отношении стафилококков и сопоставимое в отношении грамотрицательных бактерий.

Установленная антимикробная активность (выраженный бактерицидный эффект в отношении стафилококков и бактериостатический эффект в отношении кишечной палочки и синегнойной палочки) свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения механизмов и спектра антимикробного действия экстрактов очитков в отношении клинических штаммов микроорганизмов, которые могут обладать множественной лекарственной устойчивостью.