Антимикробная активность перевязочного материала, импрегнированного коллоидным серебром

Широкое применение лекарственных препаратов и снижение иммунологического статуса организма привело к тому, что ведущую роль при инфекционно-воспалительных заболеваниях стали играть лекарственно-устойчивые формы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [8]. В связи с этим возникла необходимость создания и внедрения в медицинскую практику антимикробных материалов и изделий из них, не содержащих антибиотики. Сущность этого направления состоит в создании материалов, содержащих антимикробные компоненты пролонгированного действия [10]. Кроме того, получили распространение повязки для ран, импрегни-рованные антимикробными компонентами, такими как серебро, йод, оксид меди и др. [1, 13]. Действие указанных материалов основано на выделении бактерицидных компонентов в рану, что может приводить к патологическим изменениям в тканях.

Более перспективными представляются материалы, действие которых основано на сорбции микроорганизмов из раны и последующей их инактивации в объеме повязки. Одним из таких материалов является сорбционный материал, представляющий собой микроволокни-стую полимерную матрицу с иммобилизованными частицами оксигидроксида алюминия [6]. Перевязочный материал за счет действия оксигидроксида алюминия эффективно сорбирует и удерживает микроорганизмы. Однако частицы оксигидроксида алюминия не оказывают бактерицидного действия, что может привести к размножению микроорганизмов в объеме материала повязки и опасности повторного заражения.

Цель работы: исследование in vitro влияния коллоидного серебра, адсорбированного на частицах оксигидроксида алюминия, на жизнеспособность микроорганизмов в объеме перевязочного материала и изучение возможности возникновения резистентности микроорганизмов к антимикробному агенту, входящему в состав перевязочного материала.

Материал и методы

В качестве объектов исследования использовали образцы перевязочного материала (ПМ) с иммобилизованными частицами оксигидроксида алюминия, импрегни-рованного коллоидным серебром, и образцы ПМ без серебра [3].

Количественную оценку антимикробной активности образцов ПМ с различным содержанием коллоидного серебра проводили на культуре E. coli 7935 in vitro тест-методом AATCC 100–2004 [11]. Содержание оксигидроксида алюминия на всех образцах ПМ составляло 34%. Содержание коллоидного серебра варьировало в пределах от 0,38 до 3,65 мкг/см2. На образцы ПМ диаметром 47 мм наносили 1 мл культуры микроорганизма E. coli 7935 концентрацией 1,0х105 КОЕ/мл до полного поглощения суспензии. Образцы инкубировали при температуре (37±1) °C в течение 24 ч. Затем бактерии с перевязочного материала элюировали встряхиванием во флаконах со 100 мл физиологического раствора (с pH, равным 7,2) и высевали 1 мл суспензии на питательный агар (Эндо ГРМ) в чашки Петри. Посевы инкубировали при температуре (37±1) °C в течение суток, подсчитывали число выросших колоний и рассчитывали процент убыли микроорганизмов в контаминированном образце. В качестве контроля использовали взвесь микроорганизмов в физиологическом растворе.

Для определения антибактериального спектра ПМ использовали штаммы бактерий S. aureus 209, P. vulgaris 4175, E. coli 7935, K. pneumoniae 2482 , P. aeruginosa 27583, С. albicans Y-3108, представляющие споровые и вегетативные, грамположительные и грамотрицательные, кокковые и палочковидные, капсульные и бескапсульные формы микроорганизмов. Для проведения исследования за основу брали метод А.А. Ворошиловой и Е.В. Диановой [4].

Из указанных штаммов бактерий готовили по 5 мл суспензий суточных агаровых культур бактерий в стерильном физиологическом растворе в концентрации 2,0х103 КОЕ/мл (6 опытных пробирок для каждого микроорганизма). В каждую опытную пробирку помещали образец исследуемого стерильного ПМ размером 20х20 мм. В качестве контроля использовали стерильную марлю соответствующего размера и взвесь бактерий в физиологическом растворе. Опытные и контрольные образцы помещали в термостат при температуре (37±1) °C. Через 24 и 48 ч из всех пробирок производили посев 0,1 мл бактериальной взвеси на питательную среду в чашках Петри.

Исследования антимикробного действия ПМ на культурах микроорганизмов E. coli 7935 и S. aureus 209 проводили, взяв за основу метод Кирби–Бауэра [12]. Образцы ПМ диаметром 47 мм помещали на газон растущего соответствующего микроорганизма в чашках Петри и инкубировали в термостате при температуре (37±1) °C. Для получения роста бактерий в виде газона использовали бактериальные суспензии с концентрацией 1,0х107 КОЕ/мл. Через 24 ч инкубации образцы удаляли с поверхности газона, а выросшие под образцами бактерии отбирали с помощью тампонов и засевали на мясопептонный агар (МПА).

Для изучения возможного возникновения резистентности культуры E. coli 7935 при многократном контакте с ПМ [7] использовали образцы с коллоидным серебром и без коллоидного серебра размером 20х20 мм. Стерильные образцы ПМ помещали в пробирки c 5 мл мясопептонного бульона (МПБ), в который инокулировали культуру E. coli 7935 в конечной концентрации 1,0х103 КОЕ/ мл и инкубировали при температуре (37±1) °C. Через сутки пробирки тщательно встряхивали, высевали по 1 мл бульона на питательную среду МПА и инкубировали в те- чение суток при температуре (37±1) °C. На следующий день учитывали количество выросших колоний, готовили из них суспензию с концентрацией бактерий 1,0х103 КОЕ/мл и помещали в приготовленную суспензию новый образец ПМ. Таким образом, проводили 10 последовательных пассажей штамма E. coli 7935 в присутствии образцов ПМ. Далее проводили изучение пассированной культуры кишечной палочки по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам и сравнивали с исходной (до пассажа) культурой E. coli 7935 [7, 9, 14]. В качестве контроля использовали взвесь бактерий без образцов ПМ.

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением пакета статистических программ STATISTICA for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде среднего значения (M) и ошибки среднего (m). Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения p менее 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования антимикробной активности ПМ (рис. 1) показали, что снижение концентрации бактерий E. coli 7935 зависит от времени контакта образцов ПМ с бактериальной суспензией и содержания коллоидного серебра. При контакте образца ПМ 1 (без серебра) с бактериальной суспензией не наблюдалось изменения концентрации микроорганизмов во всем временном интервале. При содержании коллоидного серебра 0,38 мкг/см2(образец ПМ 2) заметное сокращение количества жизнеспособных микроорганизмов отмечено после 2 ч контакта ПМ с бактериальной суспензией, но полной потери жизнеспособности бактерий не удавалось достичь даже после 24 ч контакта. При увеличении концентрации коллоидного серебра и времени контакта количество жизнеспособных микроорганизмов снижалось, причем полная потеря жизнеспособности микроорганизмов наблюдалась на образцах ПМ, содержащих 0,70 (образец ПМ 3)и 3,65 мкг/см2 серебра (образец ПМ 4) через 24 ч контакта.

Проведенные исследования показали, что в смыве образца ПМ 1 обнаруживаются бактерии в концентрации 1,0х104КОЕ/мл, что свидетельствовало об отсутствии антимикробного действия ПМ без коллоидного серебра. В смыве с образца ПМ 2 присутствовали единичные живые микробные клетки E. coli 7935, что, возможно, обусловлено недостаточной дозой коллоидного серебра для обеспечения полного бактерицидного эффекта. В смыве с образцов ПМ 3 и ПМ 4 жизнеспособных микрооганиз-мов не обнаружено, что могло быть связано с антимикробным действием коллоидного серебра.

Таким образом, минимальное количество коллоидно-

Рис. 1. Антимикробные свойства перевязочного материала в зависимости от содержания коллоидного серебра: 1 – без серебра; 2 – 0,38 мкг/см2; 3 – 0,70 мкг/см2, 4 – 3,65 мкг/см2

Таблица 1

Антимикробный спектр перевязочного материала (образец ПМ 4)

№ Тест-культура Наименование образца Концентрация микроорганизмов (КОЕ/мл) при экспозиции, ч 1 12 24 48 1 S. aureus 209 Физиологический раствор 205,67±25,15 200,67±12,01 189,33±14,01 194,00±11,27 2 Марля 192,33±7,51 204,33±18,58 195,67±23,18 195,33±9,29 3 ПМ 180,00±14,0 144,33±7,77 11,67±3,06 0 4 P. aeruginosa 27583 Физиологический раствор 206,00±5,57 202,00±5,29 199,00±7,0 202,67±5,51 5 Марля 196,33±3,51 199,00±2,65 199,00±1,73 202,00±2,65 6 ПМ 196,67±4,16 148,67±3,06 17,33±1,15 17,00±1,00 7 E. coli 7935 Физиологический раствор 203,00±3,61 200,00±2,00 196,67±4,16 182,33±4,04 8 Марля 201,33±1,53 198,0±2,65 194,0±3,61 200,00±1,00 9 ПМ 200,00±3,00 202,67±3,06 5,33±1,53 5,00±1,00 10 P. vulgaris 4175 Физиологический раствор 204,33±2,08 201,67±3,21 199,33±4,04 203,67±3,51 11 Марля 199,33±2,08 193,67±2,08 198,00±2,00 113,00±2,65 12 ПМ 187,67±4,04 55,00±3,61 0 0 13 K. pneumoniae 2482 Физиологический раствор 202,66±2,52 199,00±2,64 197,33±3,06 148,67±3,21 14 Марля 199,67±1,53 198,30±2,89 198,66±1,53 127,00±3,00 15 ПМ 199,67±1,53 17,33±1,15 9,00±1,00 9,67±0,58 16 C. albicans Y-3108 Физиологический раствор 201,68±2,08 200,00±2,00 198,66±2,31 160,67±2,08 17 Марля 199,23±2,52 199,00±2,65 200,63±2,08 150,35±3,07 18 ПМ 199,00±1,73 118,48±1,15 61,33±1,53 35,00±2,00 го серебра в перевязочном материале, необходимое для ПМ, составило 0,70 мкг/см2.

достижения полного бактерицидного эффекта в объеме Эффективность антимикробного действия ПМ с кол-

а)                                                       б)

в)

г)

Рис. 2. Состояние газона E. coli 7935 (а, б) и S. aureus 209 (в, г) после удаления диска ПМ: без серебра (а, в), с коллоидным серебром (б, г)

лоидным серебром (табл. 1) зависела от вида микроорганизмов, времени контакта и строения клеточной стенки микроорганизма и снижалось в ряду: Р.vulgaris 4175 – S.aureus 209 – E. coli 7935 – K. pneumoniae 2482 – P. aeruginosa 27583 – C. albicans Y-3108. Наиболее устойчивой к действию коллоидного серебра оказалась культура C. albicans Y-3108, что, вероятно, обусловлено строением клеточной стенки и наличием спор (бластоспор, хламидиоспор).

Изучение антимикробного действия ПМ (концентрация коллоидного серебра – 3,65 мкг/см2) показало, что через сутки на поверхности мясопептонного агара под образцами с серебром концентрация микроорганизмов уменьшилась на три порядка и составила 104КОЕ/ мл, тогда как под образцами без серебра – на два порядка, составив 105 КОЕ/ мл (рис. 2).

Следует отметить, действие материала распространялось только на об-

Таблица 2

Резистентность культуры E.coli 7935 к действию антимикробного агента перевязочного материала

Свойства	E. coli 7935 и ПМ без коллоидного серебра	E. coli 7935 и ПМ с коллоидным серебром	E. coli 7935 (исходная культура)
Культуральные Морфологические Биохимические Заключение	На среде Эндо красные колонии с металлическим блеском, на среде Левина – темнофиолетовые колонии Грамотрицательные палочки, не образуют спор Цитохромоксидаза “–” каталаза “+” уреаза “–” индолообразование “+” образование сероводорода “–” утилизация цитрата Симмонса “–” подвижность “+” ферментация глюкозы и лактозы до кислоты и газа Все свойства соответствуют культуре E. coli 7935 (исходная культура)	На среде Эндо красные колонии с металлическим блеском, на среде Левина – темнофиолетовые колонии Грамотрицательные палочки, не образуют спор Цитохромоксидаза “–” каталаза “+” уреаза “–” индолообразование “+” образование сероводорода “–” утилизация цитрата Симмонса “–” подвижность “+” ферментация глюкозы и лактозы до кислоты и газа Все свойства соответствуют культуре E. coli 7935 (исходная культура)	На среде Эндо красные колонии с металлическим блеском, на среде Левина – темнофиолетовые колонии Грамотрицательные палочки, не образуют спор Цитохромоксидаза “–” каталаза “+” уреаза “–” индолообразование “+” образование сероводорода “–” утилизация цитрата Симмонса “–” подвижность “+” ферментация глюкозы и лактозы до кислоты и газа E. coli

Примечание: “+” – наличие признака, “–” – отсутствие признака.

ласть под образцом, о чем свидетельствовало отсутствие зоны лизиса вокруг дисков ПМ. Следовательно, из образцов ПМ не происходило диффузии антимикробного компонента в агар с тестируемыми микроорганизмами, а действие ПМ обусловлено поглощением и сорбцией микроорганизмов, а также антибактериальным действием коллоидного серебра в объеме ПМ.

Многочисленные исследования подтверждают [2, 5], что микроорганизмы, в силу ряда причин, могут стать резистентными к различным химическим веществам, антибиотикам и т.д., а также изменять свои морфологические, культуральные и биохимические свойства. Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют о том, что все исследуемые показатели многократно пассированной культуры не изменились по сравнению с исходной контрольной культурой бактерий E. coli 7935.

Таким образом, многократное воздействие ПМ с адсорбированным коллоидным серебром в концентрации 3,65 мкг/см2 на суспензию бактерий E. coli 7935 не приводило к изменению свойств тестируемого микроорганизма.

Выводы

• 1.    Перевязочный материал на основе микроволокнис-той полимерной матрицы с иммобилизованными частицами оксигидроксида алюминия, импрегнирован-ный коллоидным серебром, обладает антибактериальной активностью и сорбционной способностью. Перевязочный материал без серебра обладает только сорбционной активностью, а адсорбированные микроорганизмы сохраняют жизнеспособность. Коллоидное серебро в концентрации выше 0,70 мкг/см² придает перевязочному материалу бактерицидные свойства.

• 2.    Перевязочный материал, содержащий коллоидное серебро в концентрации 3,65 мкг/см², обладает широким спектром антимикробной активности, которая зависит от вида микроорганизма и времени его контакта с перевязочным материалом.

• 3.    При многократном воздействии антимикробного агента, входящего в структуру перевязочного материала, на микробные клетки E. coli 7935 не происходит изменений их морфологических, культуральных и биохимических свойств, что является одним из показателей безвредности перевязочного материала.

Работа выполнена при финансовой поддержке ГК 14.527.12.0001 и Программы V.37.3.