Антиоксидантная активность гидролизата сывороточных белков

Окисление является жизненно важным процессом для аэробных организмов, в том числе позвоночных животных и людей, хотя приводит к образованию свободных радикалов [1].

Их избыток способен подавлять защитные ферменты, такие как супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза, и вызывать разрушительные и летальные клеточные эффекты (например, апоптоз) за счет окисления мембранных липидов,

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

клеточных белков, ДНК и ферментов, тем самым останавливая клеточное дыхание. Доказано, что оксидативный стресс катализирует возникновение ряда возрастных заболеваний [2].

Вещества, характеризующиеся антиоксидантным действием, способны связывать свободные радикалы посредством переноса электронов от потенциального антиоксиданта к гидроксильному радикалу, супероксидному радикалу или радикалу оксида азота [3]. Такие свойства проявляют некоторые пептиды, содержащие в углеродной цепи от 5 до 16 аминокислотных остатков. Их источником могут быть сырье и продукты животного происхождения (рыба, яйца, молоко) [4, 5]. Например, антиоксидантная активность сывороточных белков обусловлена их вкладом в синтез глутатиона (GSH) [6]. Совместное присутствие цистеина, глутаминовой кислоты и глутамина в трипептиде GSH является важным кофактором и антиоксидантом в клетках и тканях млекопитающих. Восстановленный GSH легко окисляется до дисульфидных разновидностей, окисленного глутатиона (GSSG), оксикислот. Поэтому GSSG способен инактивировать путем прямой конъюгации некоторые эндогенные и экзогенные токсины, включая токсичные металлы, перекиси липидов, хиноны, билирубин и простагландины [7–12].

Сырьевым источником сывороточных белков являются молоко и молочная сыворотка, объемы получения которой ежегодно увеличиваются [13]. Основной недостаток их применения в пищевых технологиях – наличие в молекулах антигенных эпитопов, способных вызывать аллергические реакции в организме человека. Наиболее эффективный способ снижения аллергенности сывороточных белков – их ферментативный гидролиз, приводящий к разрушению антигенных эпитопов и высвобождению биологически активных пептидов, в том числе с антиоксидантным действием [14].

В связи с представленной актуальностью разработана технология протеолиза сывороточных белков в ультрафильтрационном концентрате (УФ-концентрате) подсырной сыворотки.

Цель работы – определение эффективности гидролиза, а также установление антиоксидантной активности полученного гидролизата.

Материалы и методы

Объекты исследований – ультрафильтрационный концентрат подсырной сыворотки, выработанный с применением фактора концентрирования 3,9 на промышленной ультрафильтрационной установке MMS Swissflow UF с керамическими мембранами в условиях ПАО МК «Воронежский»; гидролизат сывороточных белков, полученный с использованием ферментных препаратов Promod 439L и Flavorpro 766МDР (Biocatalysts Limited, Великобритания). Promod 439L – протеаза, субстратом для которой является как β-лактоглобулин, так и α-лактоальбумин. Flаvоrрrо766 MDP – ферментный препарат, который может проявлять свойства как экзо-, так и эндопептидазы, отщепляя аминокислоты с высокой гидрофобностью и снижая таким образом горечь образующихся пептидов.

Экспериментальные исследования проводили в центре коллективного пользования «Структурнофункциональные исследования белков и РНК» ФГБУН «Институт белка Российской академии наук», а также центре коллективного пользования «Контроль и управление энергоэффективных проектов» ФГБОУ ВО ВГУИТ.

При анализе последовательности аминокислот в пептидах, присутствующих в изученных образцах, электрофоретическое разделение белков осуществляли на установке Mini-PROTEAN Tetra System (BIO-RAD, США), масс-хроматографический анализ вышедших белков – с применением нанопотокового хроматографа Easy-nLС 1000 (Thermo Scientific, США). Детектирование проводили на масс-спектрометре высокого разрешения Orbitrap Elite ETD (Thermo Scientific, Германия), разделение – на капиллярной колонке длинной 150 мм диаметром 75 мкм, заполненной фазой Aeris 1.7 мкм PEPTIDE XB-С18 (Phenomenex, США). Для идентификации результатов масс-спектрометрического анализа была использована коммерческая программа PeaksStudio 7.5 (Bionformatics Solutions Inc. (BSI), Канада).

Аминокислотный состав изученных образцов был установлен методом ионообменной хроматографии с постколочной дериватизацией нингидрином на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence (ГОСТ 32195–2013 и ГОСТ 32201–2013). Для определения антиоксидантной активности использовали методику А.Я. Яшина [15]. Анализ был проведен на приборе «Цвет-Яуза А01-АА».

Измерения различных величин осуществляли 5–10 раз в трехкратной последовательности. Расчеты, построение графиков и их описание проводили методами математической статистики с помощью приложений Microsoft Office 16 и MathCad 16.0.

Результаты и обсуждение

Эффективность воздействия на белковые молекулы УФ-концентрата подсырной сыворотки оценена по молекулярно-массовому распределению, длине и заряду продуктов гидролиза (рисунок 1), поскольку известно, что селективность ферментов обусловлена изменениями зарядового состояния аминокислот в активном центре фермента и в месте расщепления, а также в области, прилегающей к участкам расщепления [12, 16, 17].

й 2,501–3.0 , и"^ 2,001–2.5 Н ^ 1,501–2.0 8 ^ 1,001–1.5 CD ^ сЗ м s S    0,5–1
	95555555^^
	7//////////////////Z	WAAAAAAAZWZWZy
	у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у.у...                            .•.1.-...-.1.-.1.-.1.-.1.|
	;йййййййййй^^
		—	—	—
0              10             20             30             40             50             60 % от общего содержания пептидов | % of the total content of peptides

• □    Гидролизат сывороточных белков | Hydrolysate of whey proteins

и УФ-концентрат подсырной сыворотки | UF-concentrate of cheese whey

(а)

количество аминокислотных остатков в пептидах | number of amino acid residues in peptides и УФ-концентрат подсырной сыворотки | UF-concentrate of cheese whey

• □    Гидролизат сывороточных белков | Hydrolysate of whey proteins

(б)

1000–1099

900–999

800–899

700–799

600–699

500–599

400–499

300–399

г//////////////////>
AAZAZAZAZAZAZaJaZAZA		WAVA
WZWZMMMMMW		wazazazA
;^zwzw^^
___
иииииииии^^
.।
V/ММММММММУ^ММММММММЛ^^^
1

0               5               10              15              20              25              30

% от общего содержания пептидов | % of the total content of peptides

• □    Гидролизат сывороточных белков | Hydrolysate of whey proteins

• и    УФ-концентрат подсырной сыворотки | UF-concentrate of cheese whey

(в)

Рисунок 1. Распределение продуктов гидролиза основного аллергена сывороточных белков β-лактоглобулина: а) по молекулярной массе; б) по длине; в) по отношению молекулярной массы к заряду

Figure 1. Distribution of hydrolysis products of the β-lactoglobulin as the main allergen of whey proteins: a) by molecular weight; b) by length; c) by the ratio of molecular weight to charge

В полученном гидролизате обнаружены производные β-лактоглобулина, содержащие от 5 до 17 аминокислотных остатков с молекулярной массой от 561 до 1943 Да. Длина пептидов УФ-концентрата подсырной сыворотки составила от 5 до 25 аминокислотных остатков и молекулярная масса - от 624 до 2817 Да. Согласно литературным данным [ 18 ] некоторые короткоцепочечные пептиды могут проявлять антиоксидантные свойства, что обусловлено наличием в них определенных аминокислот. Связывание свободных радикалов пептидами происходит гидрофобными концевыми аминокислотами, такими как Ala (A), Pro (P), Val (V), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Trp (W), Tyr (Y) и Met (M) [18]. Кроме того, аминокислоты с ароматическими остатками (гистидин и пролин) могут отдавать электроны заряженным радикалам. Поэтому дальнейшие исследования заключались в установлении аминокислотного состава гидролизата сывороточных белков и его антиоксидантной активности ( рисунок 2, 3 ) в сравнении с УФ-концентратом подсырной сыворотки, являющимся сырьем для его получения.

Массовая доля аминокислоты, % Mass fraction of amino acid, %

Рисунок 2. Аминокислотный состав гидролизата сывороточных белков

Figure 2. Amino acid composition of whey proteins hydrolysate

подсырной сывороткисывороточных белков

UF-concentrate of   Hydrolysate of whey cheese whey           proteins

Рисунок 3. Антиоксидантная активность изученных образцов

Figure 3. Antioxidant activity of the studied samples

В результате протеолиза сывороточных белков в УФ-концентрате подсырной сыворотки его антиоксидантная активность увеличилась в 2 раза, что характеризует полученный гидролизат как эффективное средство для борьбы с окислительным стрессом. Степень гидролиза β-лактоглобулина, позволяющая снизить его аллергенность, составила 90–91%.

Заключение

Протеолиз сывороточных белков в УФ-концентрате подсырной сыворотки ферментными препаратами Promod 439L и Flavorpro 766МDР способствовал получению пептидов с антиоксидантными свойствами, которые могут положительно влиять на метаболические процессы в организме человека. Гидролизат сывороточных белков рекомендован для применения в технологии различных ассортиментных групп молочных продуктов диетического питания со сниженной аллергенностью, проявляющих антиоксидантные свойства.

Работа осуществлялась в рамках гранта Президента РФ на 2020–2021 гг. для молодых ученых–кандидатов наук, соглашение № 075–15– 2020–322 (МК-1267.2020.11).