Антиоксидантная и антимикробная активность пектинов ряда растений европейского севера России

Широкое применение антибиотиков и химикотерапевтических препаратов в лечении и профилактике инфекционных заболеваний показало, что, наряду с выраженным лечебным эффектом, часто проявляются такие нежелательные явления, как аллергия и интоксикация организма. Кроме того, возникают лекарственно-устойчивые формы бактерий-возбудителей инфекционного процесса. Поэтому поиск естественных и безвредных для организма соединений, обладающих антибактериальной и антитоксической активностью, является достаточно важной задачей. В качестве таких перспективных соединений могут рассматриваться пектиновые полисахариды, которые, кроме влияния на отдельные стадии иммунного ответа [1], обладают бактериостатической и бактерицидной активностью в отношении ряда патогенных и условнопатогенных бактерий, а также сорбционным, стимулирующим моторику кишечника и репаративным действием. Эти свойства пектинов могут быть использованы, например, при лечении кишечных инфекций и дисбактериозов.

Цель данной работы – скрининг антимикробной и антиоксидантной активности пектиновых полисахаридов ряда растений, широко распространенных на территории Севера России.

Экспериментальная часть

Растительный материал. Растительный материал (надземная часть растений) был собран в Кировской области на стадии цветения растений.

Общие аналитические методы. Определение количественного содержания гликуроновых кислот в выделенных фракциях пектинов проводили спектрофотометрическим методом [2], по калибровочному графику, построенному по D-галактопи-ранозилуроновой кислоте. Степень метилэтерифи-цирования (СМ) остатков гликуроновых кислот определяли по методу [3]. Содержание веществ белковой природы – с помощью метода Лоури [4] и калибровочного графика, построенного по бычьему сывороточному альбумину. Общее содержание фенольных соединений во фракциях пектиновых полисахаридов определяли с помощью реактива Фо- лина-Чиокальтеу [5] по калибровочному графику, построенному для феруловой кислоты.

Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 (Япония).

Характеристическую вязкость растворов пектинов в 1%-ном NaCl фиксировали с помощью вискозиметра ВПЖ-1 с диаметром капилляра 0,56 мм [6].

Моносахаридный состав выделенных фракций пектиновых полисахаридов определяли после их гидролиза 2М раствором трифторуксусной кислоты (TФУ) в течение 3 ч при 100°С в виде соответствующих перацетатов полиолов [7] методом хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС). ГЖХ-МС ацетатов полиолов проводили на газовом хроматографе G2589A (Agilent Tech., США) с масс-селек-тивным детектором 5973 INERT (Agilent Tech., США) на капиллярной колонке HP-5MS (0,2 мм Ø 30 м, Hewlett-Packard, США). Перацетаты полиолов анализировали при следующих условиях: температура термостата колонки 175→250ºС с градиентом температуры – 3 ºС/мин; температура испарителя – 250ºС; газ-носитель – гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 60:1); развертка – от m/z 44 до m/z 500; количество вводимой пробы – 1 мкл. В качестве внутреннего стандарта использовали мио инозит. Для расчета содержания моносахаридов использовали соответствующие коэффициенты отклика детектора.

Идентификацию остатков гликуроновых кислот в составе фракций водорастворимых полисахаридов проводили после их гидролиза 2М раствором ТФУ в течение 5 ч при 100°С методом ГЖХ-МС в виде триметилсилильных (ТМС) производных [8]. ГЖХ-МС ТМС-производных проводили при температуре термостата колонки 180→250ºС с градиентом температуры – 3ºС/мин. Температура испарителя – 260ºС. Газ-носитель – гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 60:1; развертка – от m/z 44 до m/z 500; Количество вводимой пробы – 1 мкл.

Все водные растворы и пробы для ГЖХ-МС-анализа упаривали на роторном испарителе под вакуумом при 40-45ºС. Центрифугирование растворов проводили в течение 10-15 мин при 6000-9000 об/мин.

Выделение пектиновых полисахаридов. Для выделения пектиновых полисахаридов в нативном состоянии был использован метод истощающей экстракции растительного материала 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония при 68°С, после предварительного выделения из него водорастворимых полисахаридов [9]. Для этого воздушно-сухое сырье (100 г) обрабатывали в аппарате Сокслета 96%-ным этиловым спиртом в течение 4 ч для удаления низкомолекулярных примесей и дезактивации ферментов. Затем растительный материал многократно экстрагировали водой (2 л, 68°С) до отрицательной качественной реакции на углеводы в экстрактах по фенол-сернокислотному методу [10]. Остаток сырья обрабатывали подкисленной, с помощью разбавленного раствора HCl, водой (0,5 л, 50°С, рН 4,0) для гидролиза протопектинового комплекса клеточных стенок и экстрагировали его 0,7 %-ным водным раствором оксалата аммония (2 л, 68°С) до отсутствия содержания углеводов в экс- трактах [10]. Экстракты объединяли, концентрировали упариванием, диализовали и осаждали пектины добавлением четырехкратного объема ацетона. Осадок растворяли в минимальном количестве воды и высушивали лиофильно.

Определение антиоксидантной активности. Антиоксидантную активность 0,05- и 0,1%-ных водных растворов пектиновых полисахаридов определяли спектрофотометрическим методом реакцией с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразидом в присутствии трис-НСl буфера (рН 7,9), используя тролокс в качестве положительного контроля [11].

Определение антимикробной активности. 0,2 мл суспензии суточной культуры тест-штаммов микроорганизмов в стерильном физиологическом растворе и в 1%-ном водном растворе пектиновых полисахаридов (с одинаковым титром клеток) равномерно распределяли по поверхности плотной питательной среды в чашке Петри. Чашки с культурами помещали в термостат и инкубировали при 30°С в течение 1-2 сут. Количество жизнеспособных клеток определяли по числу выросших на поверхности среды колоний. В качестве питательных сред использовали мясо-пептонный агар и питательную среду на основе панкреатического гидролизата рыбной муки.

Определение содержания фенольных соединений в пектиновых полисахаридах, их антиоксидантной и антимикробной активности проводили в трех параллельных измерениях. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение. Достоверность оценивали по t -критерию Стъюдента.

Обсуждение результатов

Для скрининга антимикробной активности были использованы фракции пектиновых полисахаридов, выделенные из состава протопектиновых комплексов клеточных стенок следующих растений: стеблей крапивы двудомной Urtica dioica L. (URD); кипрея узколистного Chamaenerium angustifolium L. (CHM); чистотела большого Chelidonium majus L. (CHL); земляники лесной Fragaria vesca L. (FRV); татарника колючего, или чертополоха Onopordum acanthium L. (ONP); купальницы европейской Trоl-lius europaеus L. (TRL); манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. (ALV). Выбор растений для выделения пектинов был обусловлен их широким распространением в регионе, а также тем, что данные виды растений используются в народной и официальной медицине для профилактики и лечения ряда заболеваний.

Выход и состав полученных фракций пектиновых полисахаридов приведен в табл. 1. Как видно из результатов, содержание пектинов в растениях составляет от 1,0 до 4,6%. Наибольшее количество пектиновых полисахаридов содержится в надземной части крапивы двудомной, кипрея узколистного, манжетки обыкновенной и купальницы европейской.

Известно, что проявляемая пектинами физиологическая активность определяется составом и особенностями строения молекул этих биополимеров, а также их макромолекулярными характеристи-

Таблица 1

Характеристика фракций пектиновых полисахаридов изученных растений

Пектин	Выход, %	Характеристическая вязкость, дл/г	СM,%	Содержание, %
				GalA	Ara	Gal	Rha	Xyl	Mаn	Glc	Белок
ONP	2,0	0,40	6	72	2,8	0,8	0,6	0,2	Сл	0,2	Сл
FRV	1,9	0,75	24	69	4,2	3,1	1,1	0,4	0,2	0,5	Сл
ALV	2,2	5,00	20	87	2,2	3,5	2,0	0,3	Сл	0,6	Сл
TRL	2,1	1,70	14	79	3,0	3,5	2,1	0,4	Сл	0,9	Сл
CHL	1,0	0,75	14	50	0,9	1,4	0,9	Сл	Сл	0,7	Сл
URD	4,6	0,90	3	77	2,9	2,8	1,2	0,2	Сл	0,7	5
CHM	2,0	3,25	32	74	1,9	1,3	0,6	0,4	Сл	0,2	5

Примечания: выход в пересчете на сухое вещество; Сл – следовые количества.

ками. Методом ГЖХ-МС в составе полученных фракций пектиновых полисахаридов в виде ТМС-производных идентифицированы только остатки галактуроновой кислоты (GalA). Максимальное их количество (87 %) содержится в пектине манжетки обыкновенной, а минимальное (50%) – в пектиновом полисахариде чистотела большого. Как следует из результатов, представленных в табл. 1, СМ остатков галактуроновой кислоты зависит от вида растения, из которого были выделены пектиновые полисахариды. Так, СМ пектиновых полисахаридов надземной части кипрея узколистного составляет 32%, а пектины крапивы и чертополоха содержат практически неэтерифицированные остатки галак-туроновой кислоты. Суммарное содержание нейтральных моносахаридов в пектинах также видоспецифично и составляет от 3,9% (CHL) до 9,9% (TRL). Преобладающими нейтральными моносахаридными остатками в полученных пектиновых полисахаридах являются остатки арабинозы (Ara), галактозы (Gal) и рамнозы (Rha). В малых количествах в их состав входят ксилоза (Xyl), манноза (Man) и глюкоза (Glс). Исключение составляют пектиновые полисахариды ONP и СНМ, в которых содержится всего 0,6% рамнозы, что может свидетельствовать о меньшей степени разветвленности их углеводных цепей (табл. 1). Следует отметить, что молекулярные массы полученных пектиновых полисахаридов существенно различаются, о чем свидетельствуют значения характеристической вязкости их водных растворов. Наименьшей характеристической вязкостью обладают водные растворы пектиновых полисахаридов чертополоха ONP (0,4), а максимальной – манжетки обыкновенной ALV (5,0). Все фракции пектиновых полисахаридов содержат незначительное количество веществ белковой природы (табл. 1).

В ряде работ по изучению физиологической активности пектиновых веществ отмечена зависимость между величиной антимикробной и антиоксидантной активности (АОА) их водных растворов. В то же время, известно, что в состав фракций пектинов могут входить как в свободном виде, так и в качестве структурных фенольных соединений, которые обладают выраженной АОА. Данные о содержании общих фенолов (в пересчете на феруло- вую кислоту) во фракциях полученных пектинов и АОА их водных растворов (относительно активности тролокса) приведены в табл. 2. Наибольшим содержанием общих фенолов характеризуются пектиновые полисахариды купальницы, чистотела, чертополоха, крапивы и кипрея. При этом величины АОА их водных растворов также максимальны. Исключение составляют только пектиновые полисахариды земляники – при низком содержании соединений фенольной природы их водные растворы обладают достаточно высокой АОА (табл. 2).

Таблица 2

Содержание общих фенолов в пектиновых полисахаридах и АОА их водных растворов

Пектин	Содержание общих фенолов, мг/г *	АОА,% *
		0,05%-ный раствор	0,1%-ный раствор
ONP	11,6±0,6	8,0±0,2	15,3±1,2
FRV	4,3±0,1	21,4±1,7	48,9±0,8
ALV	3,9±0,1	19,3±2,0	23,2±1,4
TRL	8,5±0,1	29,2±1,3	53,4±0,3
CHL	9,9±0,4	31,0±1,4	64,3±4,6
URD	21,8±1,1	37,6±1,4	70,9±1,2
CHM	21,1±0,8	86,1±0,2	83,1±1,1

Примечание: ^* – данные представлены в виде среднего арифметического значения, ± – стандартное отклонение.

При определении антимикробной активности полученных пектиновых полисахаридов было изучено действие их 1%-ных растворов на культуры тест-штаммов грамотрицательных ( Pseudomonas aeruginosa 27853 (F 51) АТСС Escherichia coli М15) и грам-положительных ( Staphylococcus aureus 6538-р АТСС) бактерий при титре клеток 10⁷ кл/мл (табл. 3).

Как следует из результатов, приведенных в табл. 3, наиболее чувствительны к пектиновым полисахаридам данных растений клетки E. coli и S. aureus . Так, пектины земляники лесной, манжетки обыкновенной, крапивы двудомной и кипрея узколистного подавляют рост клеток E. coli примерно на 30, 33, 54 и 32% соответственно. Ингибирующее действие на рост клеток S. aureus проявляют пектины ONP, ALV, CHL и CHM. При этом наиболее ярко выраженным эффектом обладают пектиновые полисахариды манжетки ALV и кипрея CHM (снижение роста золотистого стафилококка на 83 и 88% соответственно).

Более устойчивым к действию пектиновых полисахаридов оказался штамм P. aeruginosa . По отношению к нему выраженное антимикробное действие проявляют только пектиновые полисаха-

Таблица 3

Действие 1%-ных водных растворов пектиновых полисахаридов на клетки микроорганизмов

Пектин	Данные ∗	Титр жизнеспособных клеток, кл/мл·107
		E. coli	P. aeruginosa	S. aureus
ONP	Контроль	1,95±0,16	1,99±0,16	4,67±0,25
	Опыт	2,33±0,18	1,60±0,15	2,65±0,19
FRV	Контроль	2,25±0,18	1,83±0,16	0,51±0,08
	Опыт	1,57±0,12	1,60±0,15	0,35±0,07
ALV	Контроль	2,49±0,18	1,66±0,15	1,33±0,42
	Опыт	1,68±0,15	1,88±0,16	0,23±0,17
TRL	Контроль	3,59±0,22	1,74±0,15	3,40±0,67
	Опыт	4,63±0,25	1,75±0,15	3,06±0,64
CHL	Контроль	2,37±0,18	2,11±0,17	1,11±0,12
	Опыт	2,15±0,17	1,58±0,15	0,68±0,09
URD	Контроль	2,68±0,19	2,39±0,18	1,69±0,18
	Опыт	1,23±0,13	2,62±0,19	1,83±0,16
CHM	Контроль	8,34±0,33	1,51±0,14	1,33±0,02
	Опыт	5,65±0,27	1,93±0,16	0,16±0,01

Примечание: ^* – данные представлены в виде среднего арифметического значения, ± – стандартное отклонение

риды чистотела CHL – снижение числа колоний бактерий на 25%. Напротив, пектиновые полисахариды крапивы URD и кипрея CHM оказывают про-тективное действие – приводят к увеличению числа колоний клеток данного вида микроорганизмов. Сопоставляя данные таблиц 2 и 3 можно отметить, что нет однозначного влияния АОА водных растворов пектиновых полисахаридов на их антимикробную активность. Так, например, СНМ и ALV, обладая максимальным и относительно низким значением АОА, в одинаковой степени ингибируют рост клеток S. aureus , а пектиновые полисахариды купальницы TRL не активны в отношении P. аerugi-nosa и S. aureus , однако вызывают увеличение числа жизнеспособных клеток E. coli примерно на 29%, хотя их водные растворы отличаются достаточно высокими значениями АОА (таблицы 2 и 3).

Можно предположить, что антимикробный эффект, проявляемый фракциями пектинов, зависит не только от их общего значения АОА, но и от природы веществ, которые их обусловливают.

Следует также отметить, что выраженной зависимости воздействия на бактериальные клетки пектиновых полисахаридов от количества остатков галактуроновой кислоты, степени их метилэтери-фицирования, а также содержания в пектинах нейтральных моносахаридов не прослеживается. В то же время при действии пектинов на клетки S. aureus максимальный ингибирующий эффект наблюдается при использовании ALV и CHM, для водных растворов которых характерны высокие значения характеристической вязкости. Однако их воздействие на клетки грамотрицательных бактерий выражено в значительно меньшей степени (таблицы 2 и 3).

Таким образом, можно предположить, что реакции полисахаридов с клетками бактерий опре- деляются особенностями строения углеводных цепей пектиновых полисахаридов, а проявляемая ими антимикробная активность, в сочетании с достаточно известными свойствами (сорбирующими, репарирующими) пектинов, позволяет рассматривать эти соединения в качестве перспективных средств для профилактики и лечения ряда кишечных заболеваний.

Выводы

• 1.    Показано, что в состав углеводных цепей пектиновых полисахаридов, выделенных из надземных частей крапивы двудомной, кипрея узколистного, чистотела большого, земляники лесной, чертополоха, купальницы европейской и манжетки обыкновенной, входят остатки галак-туроновой кислоты и нейтральных моносахаридов: арабинозы, галактозы, глюкозы, рамнозы, ксилозы и маннозы.

• 2.    Выявлено, что водные растворы выделенных пектиновых полисахаридов обладают выраженной антиоксидантной активностью, которая зависит и от содержания в них соединений фенольной природы.

• 3.    Показано, что пектиновые полисахариды обладают выраженной антимикробной активностью в отношении тест-штаммов микроорганизмов. Наиболее чувствительными к действию пектинов являются клетки E. coli и S. aureus . Не выявлено выраженной зависимости воздействия пектинов на бактериальные клетки от их состава и величины антиоксидантной активности их водных растворов.

Авторы выражают искреннюю признательность Н.А.Чебыкиной, Ю.Е.Михалицыной, К.Н.Син-цову за оказанную помощь в работе.