Антиоксидантные комплексные экстракты из фукусовых водорослей Баренцева моря

В последнее десятилетие проявляется большой интерес к определению антиоксидантной активности (АОА) биологически активных веществ (БАВ) и их комплексов. Получение новых фитокомплексов с высокой антиоксидантной активностью из водорослей, как и других растительных продуктов, является активно развивающимся направлением. Экстракты из фукусовых водорослей перспективны в качестве антиоксидантных биопрепаратов в связи с высоким содержанием полифенолов и фукоидана, АОА которых показана рядом авторов, а также возможной ролью других БАВ водорослей, например аскорбиновой кислоты, свободных аминокислот и других [1; 2].

Фукоиданы – сложные сульфатированные полисахариды клеточных стенок бурых водорослей, состоящие в основном из L-фукозы и небольших количеств галактозы, маннозы, ксилозы, глюкозы, рамнозы и уроновых кислот [3]. На их долю приходится 10–20 % сухой массы. Фукоиданы растворимы в воде, не образуют очень вязких сред, и технология их получения может включать в себя экстракцию водой, растворами кислот или солей кальция, дальнейшую обработку ультразвуком или микроволнами. Известно, что фукоидан обладает широким спектром биологической активности, антиоксидантными и противовирусными свойствами [2].

Фенольные соединения и флоротанины. Фенолы – структурные компоненты клеточных стенок многих растений, играющие важную роль в качестве сигнальных веществ, защите от хищников, в ответ на экологические стрессы [4]. Флоротанины – вторичные метаболиты бурых водорослей, не встречающиеся в наземных растениях, – являются олигомерами или полимерами флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензол), связаны диарильными связями (фуколы), эфирными связями (флороэтолы, гидроксифлорэтолы, фукофлорэтолы), дибензодиоксиновой связью (эколы и кармалолы). Флоротанины имеют широкий диапазон размеров молекул (400–400000 Да) и содержатся в различных концентрациях (0,5–20 % от сухой массы) в бурых водорослях. Они являются эффективными ингибиторами тирозиназы и синтеза меланина. Флоротанины проявляют антиоксидантную, противоопухолевую, антигипертензивную активности, обеспечивают защиту от сердечно-сосудистых заболеваний [5].

Одним из наиболее известных антиоксидантов является аскорбиновая кислота. Фукусовые водоросли Баренцева моря содержат значительные количества витамина С – 250–400 мг в 100 г сухих водорослей [6].

Аминокислоты – важнейшие компоненты растительного сырья, принимающие участие в биосинтезе белков, ферментов, гормонов и других активных соединений как в растительном организме, так и в организме человека. Свободные аминокислоты высших растений и водорослей, не входящие в состав белков, проявляют также и антирадикальные свойства, при этом часто входят в состав антиоксидантных комплексов [7; 8].

Одним из наиболее часто применяемых методов для оценки АОА водорослевых БАВ, описанных в литературе, является реакция с радикалом DPPH [9]. Аббревиатура названия метода повторяет название радикала дифенилпикрилгидразила – diphеnylpicrylhydrazyl – 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (C18H12N5O6, M = 394,33), растворенного в этаноле, который реагирует с образцом антиоксиданта (АН) по схеме:

DPPH* + AH → DPPH-H + A*.

В результате восстановления DPPH антиоксидантом снижается фиолетовая окраска DPPH в этаноле, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 517 нм обычными методами спектрофотометрии. Значение результатов выражено через значения параметров IС 50 – концентрации анализируемых экстрактов, при которой происходит 50 %-е ингибирование свободного радикала DРРН.

Для интенсификации процесса экстракции растительного сырья в настоящее время все чаще используют микроволновую и ультразвуковую обработку [10–12]. Традиционные способы экстракции БАВ из растительных материалов характеризуются длительным временем настаивания, высокой температурой и низкой извлекающей способностью. Поэтому необходимо найти высокоэффективные и экономичные способы извлечения БАВ и их биоактивных комплексов. Ультразвуковая и микроволновая экстракции используются для получения БАВ из разных растительных материалов в последние годы и показывают свою эффективность [12; 13].

Цель работы – изучение химического состава и антиоксидантной активности новых фитокомплексов на основе сухих экстрактов фукусовых водорослей, полученных с помощью новых технологических приемов.

Материалы и методы

Для получения фитопрепаратов были использованы замороженные слоевища фукусовых водорослей: фукус пузырчатый (Fucus vesiculosus L.), фукус зубчатый (F. serratus L.) и фукус двусторонний (F. distichus L.), заготовленные в губе Ярнышная Восточного побережья Баренцева моря.

Способ получения новых фитокомплексов из фукусовых водорослей запатентован и состоит в следующем [14]. Замороженные слоевища водорослей (фукуса пузырчатого, фукуса двустороннего, или фукуса зубчатого) измельчают до размера частиц не более 1 мм, экстрагируют смесью фруктозы, глюкозы, сукрозы и воды (в молярном соотношении 1 : 1 : 1 : 11) 20 % и воды 80 % (экстрагентом 1) или смесью пролина, яблочной кислоты и воды (в молярном соотношении 1 : 1 : 3) 20 % и воды 80 % (экстрагентом 2). Для интенсификации процесса экстракцию водорослей проводят с использованием микроволнового излучения мощностью 500–600 Вт в течение 10–15 мин при температуре 40–60 °С. Далее к реакционной смеси прибавляют фермент протосубтилин из расчета 1–3 г на 100 г. Для интенсификации процесса экстракции ферментацию проводят с дополнительной ультразвуковой обработкой с частотой 42 кГц при температуре 40 °С в течение 30 мин. По окончании процесса фермент инактивируют, отделяют шрот водорослей центрифугированием. Жидкий экстракт обрабатывают флокулянтом (хитозаном или микрокристаллической целлюлозой (МКЦ)) из расчета 0,5–1,5 г на 100 г смеси. Затем смесь повторно фильтруют и центрифугируют для отделения осадка флокулянта, жидкий экстракт сушат лиофильно или с помощью распылительной сушилки. Получают сухой порошок от светло- до темно-коричневого цвета. В результате получены комплексные сухие экстракты, химический состав которых представлен в таблице.

Содержание общих полифенолов (флоротаннинов) в образцах водорослей и в экстрактах определяли по известной методике с реактивом Фолина – Чокальтеу [15] в пересчете на флороглюцин.

Содержание полисахаридов (фукоидана и альгиновой кислоты) [16], суммы свободных аминокислот (САК) [17] и аскорбиновой кислоты ¹ проводили спектрофотометрическим методом. Спектрофотометрические определения проводили на спектрофотометре UV VIS ("Jenway", США).

Технологический выход БАВ определен в пересчете на содержание действующих веществ в сухом сырье в относительных единицах (%).

Антиоксидантную активность сухих экстрактов определяли по методу DPPH в сравнении с кверцетином [9].

Все данные получены в 3-кратной повторности и статистически обработаны по общепринятым методикам в программе Statistica 10.

Результаты и обсуждение

Полученные в результате экспериментальных исследований фитокомплексы из фукусовых водорослей Баренцева моря представляют собой сухие экстракты от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, содержащие фукоидан 50–60 г, альгиновую кислоту 1–5 г, полифенолы 25–35 г, свободные аминокислоты 50–100 мг, аскорбиновую кислоту 0,5–1 г в 100 г сухого продукта, легко растворимые в воде (растворимость в воде составляет 1 г в 10 мл воды при 20 °С), обладающие высокой антиоксидантной активностью и превосходящие известный аналог примерно в 500–750 раз [18]. Физико-химические характеристики и антиоксидантная активность полученных сухих экстрактов представлены в таблице.

Таблица. Характеристика сухих экстрактов, полученных из разных видов фукусовых водорослей, г/100 г

Table. Characteristics of dry extracts obtained from different species of fucus algae, g/100 g

Вид водорослей	Фукоидан	Полифенолы	Альгиновая кислота	Аскорбиновая кислота	Сумма САК*, мг/100 г	IC 50 **, мг/мл
Fucus vesiculosus	55–60 (73–80 %)	30–35 (95–98 %)	2,2–4,6	0,7–1,0 (90–95 %)	14,5–15,9	0,035 ± 0,002
Fucus distichus	50–57 (69–79 %)	27–33 (93–97 %)	1,8–3,5	0,6–1,0 (89–93 %)	17,3–17,8	0,078 ± 0,004
Fucus serratus	52–59 (71–81 %)	25–30 (94–98 %)	3,2–5,0	0,5–0,8 (91–96 %)	13,2–14,8	0,065 ± 0,004
Кверцетин (препарат сравнения)	–	–	–	–	–	0,026 ± 0,001

Примечание. * САК – свободные аминокислоты; ** IC ₅₀ – антиоксидантная активность, мг/мл; в скобках указан выход в % от содержания в сырье.

Для наиболее важных с точки зрения антиоксидантной активности показателей (фукоидан, полифенолы, аскорбиновая кислота) рассчитан технологический выход в пересчете на содержание БАВ в сырье. Применение эвтектических растворителей (экстрагента 1 и 2) позволило достичь наиболее полной извлекаемости из водорослевого сырья полифенолов и аскорбиновой кислоты (более 90 %) с одновременным увеличением процентной доли этих веществ в экстрактах фукуса (для полифенолов 25–30 %). Содержание фукоидана в количестве 50–60 % также выгодно отличает полученные по заявляемому способу сухие экстракты фукуса от экстрактов по способу-прототипу [18], где фукоидан содержится в количестве 115 и 156 мг/г или 11,5 и 15,6 % соответственно. Свободные аминокислоты и аскорбиновая кислота в экстрактах по способу-прототипу отсутствуют.

Проведены испытания антиоксидантной активности сухих экстрактов фукусовых водорослей путем сопоставления образцов с веществом сравнения кверцетином, являющимся эталоном среди антиоксидантов растительного происхождения. Кверцетин относится к группе растительных флавоноидов. В результате исследования установлена высокая антирадикальная активность всех исследуемых экстрактов по отношению к DPPH радикалу. Наибольшая антирадикальная активность была характерна для экстрактов из фукуса пузырчатого. Их IC ₅₀ (0,035–0,038 мг/мл) соизмерима с IC ₅₀ вещества сравнения кверцетина (0,026 мг/мл). Результаты оценки антирадикальной активности исследуемых веществ по отношению к DPPH радикалу представлены на рисунке и в таблице.

0,05

0,1

Концентрация исследуемых веществ, мг/мл

Рис. График зависимости (%) ингибирования образования DPPH радикала (антирадикальной активности) от концентрации исследуемых веществ: кверцетина (1), экстракта фукуса пузырчатого (2), экстракта фукуса двустороннего (3) и экстракта фукуса зубчатого (4)

Fig. Dependency graph (%) of inhibition of the DPPH radical formation (antiradical activity) on the concentration of the test substances: quercetin (1), Fucus vesiculosus extract (2), Fucus distichus extract (3), and Fucus serratus extract (4)

В работе [19] исследованы фукозосодержащие сульфатированные полисахариды из тихоокеанских водорослей Fucus evanescens с целью определения их общей антиоксидантной активности. Полисахариды были получены различными способами: путем горячей кислотной экстракции и водным раствором хлорида кальция с последующим разделением полисахаридов с использованием анионообменной хроматографии. Показано, что экстракция водным раствором хлорида кальция позволяет получить более очищенный полисахарид с низким содержанием ламинарана, уроновых кислот и полифенолов по сравнению с полисахаридом, полученным при экстракции горячей кислотой. Все выделенные полисахариды проявляли общую антиоксидантную способность по реакции с DPPH, положительно коррелирующую с содержанием полифенолов. Авторы предположили, что полифенолы в неочищенных полисахаридных фракциях играют ключевую роль в антиоксидантной способности фукозосодержащих полисахаридов.

В исследовании [20] были выделены две сульфатированные фракции полисахарида (S1 и S2) из водорослей Undaia pinnitafida и определены их химические характеристики и антиоксидантная активность методом DPPH. Результаты показали, что два сульфатированных полисахарида содержат рамнозу в качестве основного нейтрального сахара и имеют высокое содержание сульфатов (33,99–34,29 %). Исследование позволило установить положительную корреляцию между содержанием сульфатов и антиоксидантной активностью. Антиоксидантная активность IC 50 по отношению к радикалу DPPH составляет 0,6–1,4 мг/мл соответственно для каждого полученного экстракта.

Наиболее близким способом получения антиоксидантного экстракта из бурых водорослей, в частности из бифуркаты раздвоенной и аскофиллума узловатого, является способ по патенту на изобретение ES 2997963 (Испания) [18]. Способ заключается в том, что свежие или сухие слоевища водорослей (бифуркаты раздвоенной Bifurcaria bifurcata и аскофиллума узловатого Ascophyllum nodosum) заливают водой в соотношении 3–5 г/г и измельчают в блендере, экстрагируют водой или водно-этанольной смесью в установке с применением ультразвуковой обработки. Затем отделяют шрот водорослей отстаиванием, далее жидкий экстракт центрифугируют или фильтруют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат лиофилизацией и получают сухие экстракты, содержащие полифенолы 62,4 мг в пересчете на флороглюцинол из водорослей Bifurcaria bifurcata и 44 мг в пересчете на флороглюцинол из водорослей Ascophyllum nodosum. Антиоксидантная активность IC ₅₀ по отношению к радикалу DPPH составляет 17,68 ± 2,2 мг/мл и 23,73 ± 3,83 мг/мл соответственно для каждого полученного экстракта. Недостатками способа является низкий выход полифенолов от содержания в сырье (30–40 %), невысокое содержание полифенолов в сухом экстракте (5–6,6 %), а также отсутствие в экстракте свободных аминокислот и аскорбиновой кислоты.

Анализ литературных данных продемонстрировал, что в рамках данного исследования был показан высокий уровень антирадикальной активности всех экстрактов фукуса, полученных по новому способу, существенно отличающийся от достигнутых другими исследователями значений. При этом сухие экстракты из фукуса пузырчатого характеризовались значительно более выраженной антирадикальной активностью, поскольку высокий уровень антирадикальной активности для них получен при меньшей концентрации экстракта в растворе. IC ₅₀ экстракта фукуса СЭФ-3 и СЭФ-4 сопоставима с IC ₅₀ кверцетина, и в 500–750 раз превосходит значение антиоксидантной активности образцов по способу-прототипу 17,68 и 23,73 мг/мл [18].

Заключение

По результатам проведенных исследований установлено, что фитокомплексы на основе сухих экстрактов фукусовых водорослей Баренцева моря характеризовались высокой антирадикальной и восстанавливающей активностью в проведенных тестах in vitro на уровне с препаратом сравнения кверцетином. Используемые в работе методы интенсификации процесса экстракции позволили получить фитокомплексы с высоким содержанием БАВ с сильными антиоксидантными свойствами, взаимно усиливающие общий антирадикальный эффект. Разработанный способ экстракции сырья обеспечивает достижение наиболее полного извлечения БАВ фукусовых водорослей и получение сухих экстрактов из фукусовых водорослей с усиленным антиоксидантным действием.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 17-44-510487-рег_север_а «Природные глубокие эвтектические растворители как основа "зеленых" технологий биологически активных веществ водорослей Баренцева моря».