Антиоксидантные свойства экстракта из коричневой водоросли Sargassum pallidum при стрессовом воздействии

В литературе представлено большое количество сообщений, демонстрирующих связь между стрессом и развитием различных заболеваний: язвы желудочно-кишечного тракта, гипертоническая болезнь, сердечно-сосудистые заболевания, опухоли, диабет и др. (Chrousos, 2009; Dachanidze et al . 2013). Однако биохимического обоснования возникновения стресс-индуцированных расстройств, по большей части, не известно. Одним из возможных механизмов их возникновения является пероксидация липидов клеточных мембран, которая обусловлена гиперпродукцией свободных радикалов, таких как супероксид-радикал, гидроксил-радикал, а также связанных радикалов – пероксид водорода, синглетный кислород и др. (Davies, 2000). Для нейтрализации этих радикалов в клетках живых организмов существуют антиоксидантные ферменты и неэнзиматические низкомолекулярные антиоксиданты, которые являясь «ловушками» радикалов, значительно снижают образование таких реактивных оксигенных видов и защищают организм от оксидативных повреждений. Несмотря на то, что стресс является приспособительной реакцией организма в ответ на различные абиотические и биотические факторы, в какой-то момент наступает предел прочности и срыв регуляторных систем организма (дизадаптация). При этом избыточная генерация реактивных оксигенных радикалов превышает антиоксидантную способность организма, в результате формируется оксидативный стресс, который способствует развитию патологических изменений и заболеваний.

Одним из путей восстановления нарушенных стрессом метаболических реакций организма является использование природных комплексов, обладающих высокой антиоксидантной и антирадикальной активностью, то есть способностью эффективно нейтрализовать высокотоксичные радикалы, и тем самым инактивировать оксидативный процесс. В последнее время особое внимание привлекают морские водоросли, как потенциальные источники природных антиоксидантов. В их состав входят такие биологически активные соединения, как полисахариды, аминокислоты, минералы, витамины, липиды, пищевые волокна, полифенольные соединения и др. (Yuan, Walsh, 2006; Holdt, Kraan, 2011; Sprygin et al., 2012).

Особый интерес представляют массовые виды морских водорослей, в частности, Саргассум бледный - Sargassum pallidum (Turner) C.Agardh, который относится к отряду бурых водорослей, семейства саргассовых – Sargassaceae. Саргассум традиционно используется в странах Юго-восточной Азии, как пищевой продукт с высокой биологической ценностью, а также как сырье для получения препаратов альгиновой кислоты (полисахаридный комплекс), применяющихся в качестве энтеросорбентов. Однако в России Саргассум бледный не имеет столь широкого применения в качестве продукта пищевого назначения, как например, морская капуста (Ламинария японская). При этом промысловые запасы Саргассума бледного в целом ряде районов прибрежных морей Дальнего Востока существенно превышают запасы ламинарии японской (Dulenin, 2012).

Известно, что бурые водоросли содержат значительные количества полифенольных соединений (Sprygin et al ., 2012), доминирующей группой которых являются флоротаннины. Флоротаннины представляют собой продукты полимеризации флороглюкинола (1,3,5– тригидроксибензола), обладающие широким спектром биологической активности (Ragan and Golombitza, 1986). Согласно нашим экспериментальным исследованиям содержание общих полифенолов, определенное с помощью реактива Folin-Ciocalteu (Singleton et al .,1999), составляет до 50% от сухого остатка экстракта S. pallidum . Кроме этого, в состав экстракта входят минеральные, азотсодержащие вещества, белки, жиры и жирорастворимые пигменты, стероиды, следы полисахаридов, углеводов и ряд других органических соединений.

Целью настоящей работы явилось исследование профилактического влияния водно-спиртового экстракта, выделенного из таллома морской водоросли Sargassum pallidum, на состояние антиоксидантной системы мышей в условиях острого стресса.

MATERIALS AND METHODS

Образцы водоросли S. pallidum собирали в летний период в бухте Алексеева о-в Попова зал. Петра Великого (Японское море), тщательно очищали от эпифитов, небольших беспозвоночных и частиц песка, промывали морской водой, затем дистиллированной, и высушивали при t<50⁰ С. Высушенный таллом измельчали c помощью лабораторной мельницы и экстрагировали 95% этиловым спиртом в соотношении 1:2 (по объему) сырье: экстрагент. Экстракцию проводили методом реперколяции, выход экстракта составлял 1 л на 1 кг исходного сырья. После экстракции полученное извлечение отстаивали в холодильнике при температуре 0-4 ^оС для формирования осадка и удаления из экстракта избытка полисахаридов и углеводов. После отстаивания экстракт фильтровали, упаривали под вакуумом при температуре не выше 37^оС.

При определении количественного состава экстракта среди биологически активных фракций доминирующей была фенольная фракция, поэтому стандартизацию экстракта из саргассума проводили по суммарному содержанию полифенолов (ПФ) и дозу вводимого препарата рассчитывали в мг общих ПФ на 1 кг массы животного. Готовая субстанция на основе продукта экстракции таллома саргассума обладает низкой токсичностью (ЛД 50 составляет 2000 мг/кг) и не оказывает вредного действия при длительных введениях в желудок и парэнтерально, что позволило провести экспериментальные исследования на животных.

Эксперимент проводили на белых беспородных мышах-самцах массой 20 - 30 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. Острый стресс моделировали путем вертикальной фиксации животных за дорсальную шейную складку на 24 часа. Контрольные животные содержались в стандартных условиях вивария. Препараты вводились в желудок через зонд дважды: непосредственно перед вертикальной фиксацией и через 6 часов после первого введения. В качестве препарата сравнения использовали официальный стандартизованный экстракт элеутерококка ( Eleutherococcus senticosus (Rupr. & Maxim.) - известного адаптогена и стресс-протектора (Davydov and Krikorian, 2000). Экстракты саргассума и элеутерококка освобождали от спирта путем упаривания в вакуумном испарителе, доводили дистиллированной водой до требуемого объема и вводили мышам внутрижелудочно через зонд в виде водной взвеси. Разведение проводили таким образом, чтобы терапевтическая доза, принятая в данном исследовании, а именно 100 мг общих полифенолов/кг массы (Vengerovskii et al. , 2012) составила по объему 5,0 мл/кг массы, что соответствовало 0,1 мл разведенного препарата на одну особь. Животные из группы «чистый стресс» получали дистиллированную воду в объеме, равном объему вводимых препаратов.

Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в вакуэты с 1% раствором гепарина. Для отделения плазмы кровь центрифугировали 10

мин при 3000 об/мин, затем образцы плазмы замораживали при t = – 800C для дальнейшего определения биохимических показателей. Печень после извлечения промывали в физиологическом растворе и также замораживали в рефрижераторе при t=–800C.

В ходе исследования были выделены четыре группы животных по 10 мышей в каждой: 1-я группа – контроль (интактные); 2-я группа – вертикальная фиксация (чистый стресс); 3-я группа – вертикальная фиксация + экстракт саргассума; 4-я группа – вертикальная фиксация + экстракт элеутерококка. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН (протокол № 7 от 16.12.2015г).

Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

RESULTS AND DISCUSSION

Согласно данным литературы, при различном экстремальном воздействии в системе антиоксидантной защиты происходят существенные изменения в результате избыточного образования свободных радикалов (Sahin, Gümüşlü, 2007). Оценивая состояние антиоксидантной системы животных, подвергнутых стрессовому воздействию (табл.2), было выявлено снижение величины антирадикальной активности плазмы крови на 46% (р<0,001) и на 40% ниже (р<0,001) контрольного уровня зафиксирована активность супероксиддисмутазы (СОД) - ключевого фермента антиокислительной защитной системы. Также отмечалось снижение уровня восстановленного глутатиона (Г-SH) печени почти в 2 раза и активности глутатионредуктазы (ГР) на 26% (р<0,001) - фермента, выполняющего главную роль в поддержании определенной концентрации Г-SH внутри клетки. Активность другого ключевого фермента глутатионового звена – глутатионпероксидазы (ГП), катализирующей восстановление перекисей и гидроперекисей, также была снижена на 35% (р<0,001).

Такие нарушения в показателях системы антиоксидантной защиты можно определить как ее истощение. Нарушения антиоксидантной защитной системы в условиях стресса проявлялись также в увеличении количества малонового диальдегида (МДА) на 68% (р<0,001). Данный показатель характеризует высокую активность перекисного окисления жирных кислот, входящих в состав мембранных липидов, что сопровождается повышением проницаемости клеточных мембран в различных тканях (Sahin, Gümüşlü , 2007; Fomenko et al., 2013).

Введение экстракта из саргассума (3-я группа) на фоне стресс-воздействия оказало существенное антиоксидантное действие, о чем свидетельствует восстановление показателей глутатионовой системы по сравнению со 2-й группой мышей, не получавших экстракты (табл.2). Так, уровень Г-SH в ткани печени повысился на 40% (p<0.001), а активности ГП и ГР плазмы крови сохранялись на уровне контрольных величин. Снизилось содержания МДА в плазме крови на 18% (p<0.001) при одновременном повышении уровня АРА на 37% (p<0.001), а также активности СОД на 21% (p<0.001).

У животных, получавших экстракт элеутерококка на фоне стресса (4-я группа), исследуемые антиоксидантные показатели также имели тенденцию к стабилизации. При сравнении со 2-й группой значительно повысился уровень АРА (на 73%; p<0.001) и активность СОД (на 50%; p<0.001), снизилось содержание МДА (на 32%; p<0.001). В свою очередь, показатели глутатионовой системы у этих мышей, в частности активность ГП и ГР, были несколько ниже контрольных величин и уступали аналогичным параметрам в группе животных, получавших экстракт саггассума. Данный эффект обусловлен, по нашему мнению, тем, что в составе водорослевого экстракта присутствует фенольная фракция, относящаяся к особой группе вторичных метаболитов (флоротаннины) и обладающая антиоксидантными свойствами. И хотя полифенолы, содержащиеся в бурых водорослях существенно отличаются по химическому составу от наземных растений, но они также обладают способностью связывать свободные радикалы, нейтрализуя их поражающее действие в организме (Yuan, Walsh, 2006), что и обусловливает антиоксидантный эффект экстракта из S. pallidum. Следовательно, применение экстракта из S. pallidum при стресс-вертикальной фиксации сопровождалось выраженным профилактическим действием, которое

Table 1. Влияние стресса на весовые показатели внутренних органов мышей и их коррекция экстрактом из бурой водоросли Sargassum pallidum и элеутерококком. (M±m)

Примечание. Здесь и в таблице 2 изменения статистически достоверны: 1 р<0.05, 2 р<0.01, 3 р<0.001 – при сравнении с контролем; а р<0.05, б р<0.01, в р<0.001 – со 2-й группой.

Table 2. Влияние стресса на показатели антиоксидантной защиты печени и плазмы крови мышей и их коррекция экстрактом из бурой водоросли Sargassum pallidum и элеутерококком (M±m)

Примечание. Условные обозначения: Г-SH – восстановленный глутатион, ГР – глутатионредуктаза, ГП – глутатионпероксидаза, МДА – малоновый диальдегид, СОД – супероксиддисмутаза, АРА – антирадикальная активность.