Антиоксидантные свойства экстрактов растений семейства Lamiaceae, произрастающих в Республике Коми

В настоящее время все большее внимание уделяется поиску природных антиоксидантов для защиты организма человека от активных форм кислорода (АФК). Хорошо известны растения с высокой антиоксидантной активностью, такие как розмарин лекарственный (Rosmarinus officinalis), шалфей лекарственный (Salvia officinalis), тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris), душица обыкновенная (Origanum vulgare), базилик благородный (Ocimum basilicum) – все они из семейства Lamiaceae и относятся к растениям южных широтных групп [1]. В последние годы актуальным направлением ботанического ресурсоведения является поиск растений -антиоксидантов, произрастающих на ранее не изученных северных территориях России, в том числе и в Республике Коми. При проведении выборочного исследования антиоксидантной активности экстрактов представителей сем. Lamiaceae, насчитывающего во флоре европейского Северо-Востока России 26 видов из 16 родов, представляет интерес оценить антиоксидантную активность экстрактов как ранее не исследованных видов, так и изученных, образцы которых отбирались в более южных местах произрастания. Кроме практического интереса эти исследования могли бы дать ответ на вопрос о связи между условиями среды обитания растений и антиоксидантной активностью, обусловленной варьирующим в растениях содержанием полифенолов [2, 3]. Эти соединения обладают способностью прямо нейтрализовать свободные радикалы [4] и хелатировать ионы металлов, включая железо [5]. В то же время известно, что в определенных условиях полифенолы могут участвовать в генерации АФК и действовать как прооксиданты [6, 7]. В исследованиях на животных показано антиму-тагенное и антиканцерогенное действие полифенолов, а также их положительный эффект при лечении многих заболеваний сердечно-сосудистой и нервной системы, в профилактике рака и старения [8]. Для изучения антиоксидантной активности экс- трактов и их компонентов используются два основных подхода. В первом случае применяют физикохимические методы, во втором – живые организмы от млекопитающих до микробных тест-систем. В последнем случае микроорганизмы могут быть использованы как относительно простые и недорогие тест-системы [9, 10]. В настоящей работе нами исследована антиоксидантная активность экстрактов выборочных видов растений сем. Lamiaceae с использованием генно-инженерных штаммов бактерий Escherichia coli и трех широко используемых химических методов.

Материалы и методы

Получение экстрактов . Метанольные экстракты получали из растений, принадлежащих к видам семейства Lamiaceae. Надземную часть растений высушивали при комнатной температуре и измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Навески 0,1 г экстрагировали 10 мл 96%-ного метанола в круглодонной колбе при нагревании с обратным холодильником на водяной бане 1 час. После охлаждения экстракт фильтровали и выпаривали досуха.

Определение радикалсвязывающей активности (РСА) с ДФПГ^•. Способность растительных экстрактов к связыванию свободного радикала ДФПГ^• определялась, как описано в работе [11]. Радикалсвязывающую активность (РСА) рассчитывали по формуле:

РСА (%) = (1 – поглощение образца / поглощение контроля) х 100.

IC 50 – концентрация субстрата, при которой 50% радикалов связывается с тестируемым образцом. Для расчета IC 50 выбирали отрезок между двумя точками на прямолинейном участке графика «доза–эффект».

Определение хелатирующей способности. Способность экстрактов к хелатированию ионов железа определяли по методу, описанному в работе [12]. Хелатирующую способность вычисляли по формуле:

ХС (%) = (1 – поглощение образца / поглощение контроля) х 100.

EC 50 – концентрация субстрата, при которой ионы металлов хелатируются на 50%, рассчитывалась, как указано выше, для IC 50 .

Определение общего содержания растительных полифенолов. Содержание полифенолов определяли с реактивом Фолина-Чикольте [13], результаты выражали в мг эквивалентах галловой кислоты/ г сухого веса экстракта.

Определение антиоксидантной активности (АОА) c помощью микробных тест-систем. Использованные в работе генно-инженерные штаммы Escherichia coli NM3021 и NM3041 были сконструированы путем трансформации бактерий дикого типа BW25113 (штамм получен из CGSC E. coli Genetic Stock Center) плазмидами pKT1033 ( katG::lacZ ) (получена от проф. K. Tao, Япония) и pRS 415 katF5 ( rpoS::lacZ ) (получена от проф. A. Eisenstark, США).

Плазмиды несут слияние промоторов генов katG и rpoS со структурным геном β-галактозидазы, что позволяет судить о степени экспрессии этих генов по уровню активности β-галактозидазы. Ген katG кодирует каталазу HPI, которая индуцируется в ответ на повышение концентрации эндогенной и экзогенной перекиси водорода. Ген rpoS кодирует σ^S субъединицу РНК-полимеразы (RpoS), контролирующую экспрессию большого числа генов общего стрессового ответа, индуцируется при замедлении роста и обеспечивает устойчивость ко многим стрессам.

Бактерии культивировали на минимальной среде М9 [14] с глюкозой (0.15%), казаминовыми кислотами (0.2%) и тиамином (10 мкг/мл). Ночную культуру выращивали в термостате при 37°С. Клетки из ночной культуры центрифугировали и переносили в колбы объемом 250 мл, содержащие 100 мл среды М9, до начальной OD 600 = 0.1 и выращивали на качалках при скорости вращения 140 об/мин и температуре 37°С до OD 600 = 0.6. Далее культуру центрифугировали и ресуспендировали в 8 мл среды M9. В ячейки иммунологического планшета добавляли 5 мкл исследуемых экстрактов, 5 мкл концентрированных клеток (до конечной OD 600 = 0.1) и среду M9 до общего объема 200 мкл. OD 600 измеряли до и после добавления клеток, чтобы учесть цветность экстракта. Планшеты культивировали на качалках (140 об/мин, температура 37°С) 20 мин, измеряли OD 600 и в опытные ячейки вносили Н 2 О 2 до концентрации 0.1 и 4 мМ. Культивирование продолжали в течение 30 мин, после чего измеряли OD 600 на микропланшетном спектрофотометре BioRad xMark. Полученные значения использовали для подсчета удельной скорости роста (µ).

µ = ∆ln OD 600 /∆t, где t – время, час.

Антиоксидантную активность определяли, как способность экстракта защищать клетки от действия перекиси водорода и количественно выражали как отношение µ в присутствии экстракта к значению µ без экстракта.

Определение β-галактозидазы на планшетах. Активность β-галактозидазы вычисляли по методу Миллера (Miller 1972) [14], модифицированному нами для измерения на планшетах. По 30 мкл культуры из каждой ячейки первого планшета (для определения АОА) переносили на второй с 90 мкл восстановительного буфера в каждой ячейке, добавляли 1 мкл толуола и 1 мкл дезоксихолата. Инкубировали 30 мин при 37°С и 140 об/мин. Затем добавляли 30 мкл 2-нитрофенил β-D-галактопира-нозида (ОНФГ), инкубировали 1 час, останавливали реакцию добавлением 30 мкл K 2 CO 3 и измеряли OD 420 и OD 550 . Каждое измерение дублировали контролем без ОНФГ (вместо ОНФГ добавляли 30 мкл восстановительного буфера). Активность β-галакто-зидазы выражали в единицах Миллера, рассчитанных по формуле:

(OD420 - 1.75 × OD550 / OD600) × 100, где OD420 и OD550 – оптическая плотность образцов, OD600 – оптическая плотность бактериальной культуры, 100 – коэффициент, учитывающий продолжи- тельность экспозиции с ОНФГ и разведение исходной культуры.

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные обрабатывали, вычисляя стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение из не менее, чем трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий оценивали согласно t -критерию Стьюдента, различия считались значимыми при р < 0.05.

Результаты исследований

Радикалсвязывающая активность испытанных экстрактов варьировала в широких пределах, от высоких значений у тимьяна обыкновенного (2.8) и тимьяна Талиева (2.8) и пикульника двунадрезно-го (3.5) до низкого – у будры плющевидной (31.9) (таблица). Для сравнения, Тролокс (водорастворимый аналог витамина Е, используемый в качестве общепринятого стандарта) в наших условиях имел показатель – 0.01. Наиболее высокой хелатирующей способностью обладали экстракты змееголовника Рюйша и яснотки стеблеобъемлющей. Следует иметь в виду, что чем ниже абсолютное значение IC 50 и EC 50 , тем выше, соответственно, ради-калсвязывающая и хелатирующая активности. Наиболее высокое содержание полифенолов обнаружено в экстрактах тимьяна обыкновенного и тимьяна Талиева. Отмечена положительная корреляция между содержанием полифенолов в экстрактах и их радикалсвязывающей активностью (r = 0.8; P < 0.01).

Указанные в таблице значения параметров получены при содержании 1.67 мг сухого веса в

1 мл ДМСО. Добавление всех экстрактов в этой концентрации к растущим культурам бактерий E. coli NM3021, несущим слияние katG::lacZ , вызывало снижение удельной скорости роста (µ), величина которого зависела от вида растений. Наибольшим эффектом в этом отношении обладали экстракты тимьяна обыкновенного и тимьяна Талиева, снижавшие скорость роста на 41 и 28%, соответственно.

Окислительный стресс, вызванный обработкой бактерий 4 мМ пероксида, приводил к снижению скорости роста E. coli NM3021 с 0.97 до 0.17 час^-1. Добавление всех экстрактов в среду культивирования существенно снижало бактериостатическое действие пероксида. Наибольшим эффектом обладали экстракты змееголовника Рюйша и тимьяна обыкновенного, повышавшие скорость роста в присутствии пероксида в 6.1 и 5.6 раза (рис. 1). Присутствие в среде экстрактов оказывало также стимулирующее действие на экспрессию антиоксидантного гена katG , который играет существенную роль в защите E. coli от пероксидного стресса. Обработка бактерий экстрактами в условиях нормального роста (отсутствие пероксида) вызывала заметное повышение экспрессии katG::lacZ. Наибольшее повышение этого показателя отмечено у экстрактов яснотки пурпурной и будры плющевидной, обработка которыми приводила к повышению экспрессии слияния в 2.5 раза по сравнению с необработанными клетками (рис. 1). Поскольку katG является Н 2 О 2 -индуцибельным геном, то добавление 4 мМ Н 2 О 2 вызывало, как и следовало ожидать, повышение экспрессии katG :: lacZ . Предобработка клеток экстрактами заметно стимулировала Н 2 О 2 -индуцируемую экспрессию слияния на 30–50 %.

Радикал-связывающая активность (РСА), хелатирующая способность (ХС) и содержание полифенолов в экстрактах

Растения	Места сбора	Время сбора	РСА IC 50 мг/мл	ХС EC 50 , мг/мл	Полифенолы мг/г сух. в.
Thymus serpillum Тимьян обыкновенный	г. Сыктывкар	2008	2.8±0.05	49.6±5.4	1.9±0.01
Thymus talijevii	Интинский
Тимьян Талиева	р-н	2008	2.8±0.04	32.2±0.7	2.1±0.04
Galeopsis bifida Пикульник двунадрезный	c. Выльгорт	2011	3.5±0.05	28.8±0.5	1.5±0.02
Galeopsis bifida Пикульник двунадрезный	г. Сыктывкар	2010	14.9±0.37	39.3±0.35	0.35±0.02
Galeopsis speciosa Пикульник красивый	с. Выльгорт	2011	4.7±0.13	20.0±2.3	1.2±0.01
Prunella vulgaris Черноголовка обыкновенная	с. Выльгорт	2010	4.9±0.04	49.7±1.5	0.99±0.01
Dracocephalum ruyschiana Змееголовник Рюйша	Усть-Цилемский р-н	2011	5.1±0.14	13.7±0.7	1.0±0.02
Lamium purpureum Яснотка пурпурная	с. Выльгорт	2011	9.0±0.25	29.6±0.7	0.6±0.008
Lamium amplexicaule Яснотка стеблеобъемлющая	c. Выльгорт	2011	14.0±0.32	15.4±0.7	0.38±0.003
Glechoma hederaceа Будра плющевидная	г. Сыктывкар	2011	31.9±1.6	30.6±1.2	0.21±0.01

трактов и экспрессия слияния katG::lacZ в клетках

E. coli NM3021.

Рис. 2. Антиоксидантная активность (АОА) экстрактов и экспрессия слияния rpoS::lacZ в клетках

E. coli NM3041.

Выявлены прямая зависимость между антиоксидантной активностью экстрактов (АОА) и содержанием в них полифенолов (r = 0.6; P < 0.05) и обратная зависимость между АОА и степенью ингибирования роста бактерий экстрактами (r = - 0.7; P < 0.05). Кроме того, обнаружена прямая зависимость между экспрессией katG::lacZ (в отсутствии пероксида) и РСА (r = 0.76; P < 0.01).

При снижении концентрации экстрактов в пробах в 10 раз не отмечено ингибирования роста E. coli NM3021. В то же время, в этих условиях сохранялось как антиоксидантное действие всех экстрактов, так и способность к стимуляции экспрессии katG::lacZ. Предобработка экстрактами увеличивала скорость роста в условиях окислительного стресса в 1.7–2.9 раза и экспрессию katG::lacZ (в отсутствии пероксида) в 1.4–1.9 раза по сравнению с клетками, не обработанными экстрактами. Отмечена положительная корреляция между этими двумя параметрами (r = 0.66; P < 0.05).

Другой использованный нами в этой работе штамм E. coli NM3041 несет слияние rpoS::lacZ . В отличие от E. coli NM3021, только четыре экстракта вызывали заметное ингибирование роста клеток NM3041. Из них наибольший эффект оказывали экстракты тимьяна обыкновенного и тимьяна Та-лиева, ингибирующие рост на 28 и 27%, соответственно. Хотя все экстракты защищали E. coli NM3041 от пероксидного стресса, защитный эффект был значительно ниже, чем в культурах NM3021 (рис. 2).

Влияние экстрактов на экспрессию rpoS::lacZ значительно отличалось от их действия на katG::lacZ. Так, добавление экстрактов в среду культивирования в отсутствии пероксида не только не стимулировало экспрессию rpoS::lacZ, но даже наблюдалось небольшое ингибирование на 5–18% от уровня в необработанных клетках. Эта тенденция сохранялась и в клетках, обработанных последовательно экстрактами и пероксидом. Экспрессия rpoS::lacZ в этом случае была в среднем в два раза ниже, чем в клетках, не обработанных экстрактами (рис. 2).

При снижении концентрации экстрактов в пробах в 10 раз наблюдалась небольшая стимуляция роста бактерий E. coli NM3041 (в среднем на 5%). В этих условиях экстракты сохраняли способность к защите бактерий от пероксидного стресса, увеличивая скорость роста в 1.7–2.6 раза по сравнению с необработанными клетками. Экспрессия rpoS::lacZ в клетках, обработанных последовательно экстрактами и пероксидом, была на 12-30% ниже, чем в клетках, не обработанных экстрактами.

Обсуждение результатов

Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что исследуемые экстракты могли оказывать одновременное антиоксидантное действие на бактерии несколькими разными путями. Наличие радикалсвязывающей активности у части экстрактов, выявленное в тесте с ДФПГ•, указывает на возможность прямого взаимодействия компонентов экстрактов с АФК [4]. Способность к хелатированию ионов железа также может вносить вклад в антиоксидантное действие экстрактов благодаря ингибированию образования АФК в реакции Фентона [5]. В то же время полученные данные указывают на то, что экстракты могли защищать растущие E. coli от пероксидного стресса не только прямо, но и косвенно, стимулируя экспрессию антиоксидантных генов, в частности, гена katG, кодирующего катала-зу-гидропероксидазу HPI. Ген katG входит в состав регулона, контролируемого транскрипционным фактором OxyR. Активация OxyR происходит при взаимодействии низких концентраций H2O2 с его ре-докс-чувствительными сайтами [15]. Одной из возможных причин наблюдаемого увеличения экспрессии katG может быть продукция пероксида компонентами экстрактов, в первую очередь, полифенолами. Известно, что в определенных условиях полифенолы могут участвовать в генерации АФК и действовать как прооксиданты [6, 7]. Ранее нами установлено, что ряд растительных экстрактов и полифенолов способны генерировать пероксид в количествах, достаточных для активации OxyR [7, 9]. Суммируя приведенные выше данные, можно предположить, что исследуемые экстракты могли активировать антиоксидантные системы бактерий, действуя как прооксиданты.

Нами также проверено влияние исследуемых экстрактов на экспрессию гена rpoS, кодирующего σ^S субъединицу РНК-полимеразы (RpoS), которая контролирует экспрессию большого числа генов общего стрессового ответа и обеспечивает устойчивость ко многим стрессам. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях нормального роста экстракты исследованных растений не стимулировали экспрессию rpoS . При пероксидном стрессе присутствие экстрактов вызывало даже снижение экспрессии rpoS . Вероятно, в условиях высокой активности генов OxyR-регулона, обеспечивающей достаточный уровень защиты от пероксида, отпадает необходимость для индукции RpoS-регулона [16].

Следует отметить, что из-за высокой стоимости тестов с применением животных к настоящему времени для первичного скрининга растительных экстрактов на АОА наиболее широко используются стандартные химические методы in vitro. Данная работа показывает, что генно-инженерные штаммы бактерий E. coli могут быть использованы для указанных выше целей как относительно простые и недорогие биологические тест-системы. В то же время исследование действия экстрактов на бактерии имеет и другое более фундаментальное значение. Все более широкое признание получает взгляд на совокупную кишечную микрофлору человека и животных как отдельный орган, нормальное функционирование которого имеет важное значение для поддержания здоровья. У E. coli важная ступень в жизненном цикле связана с пребыванием в кишечнике. В процессе переваривания пищи эти бактерии могут прямо контактировать с компонентами экстрактов медицинских растений и принимать участие в их метаболизме [17].

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Программы интеграционных исследований УрО РАН № 12-И-4-2072 и частичной поддержке гранта РФФИ-Урал №10-04-96017.