Антиоксидантный и антибактериальный потенциал эпифитных микроорганизмов наземных и водных растений

EDN: JJMNRD

Термин «эпифит» (от греч. epi – на, и phyton – растение) ввел Шарль Бриссо-де-Мирбель (Charles Brisseau-Mirbel) в 1820-х гг. для растений, обитающих на других без паразитизма, получающих влагу и питание из воздуха (орхидеи, бромелии).

Эпифитные бактерии – это микроорганизмы, обитающие на поверхности растений. Ранее для их обозначения использовали более общие термины, такие как «поверхностная микрофлора растений» или «филлофитная микрофлора». Сам термин «эпифитные бактерии» получил широкое распространение уже во 2-й половине XX в. и используется в микробиологии растений для обозначения бактерий, заселяющих надземные органы растений и существующих за счет продуктов их экзоосмоса по настоящее время. Эпифитная микрофлора представляет собой сложное сообщество микроорганизмов, включающее молочнокислые бактерии, бациллы, дрожжи, актиномицеты, плесневые грибы и другие формы. Ее состав варьирует в зависимости от вида растения, состояния поверхности органов, влажности, pH среды, температуры и доступности питательных веществ [Галиева, Галицкая, Селивановская, 2023].

Эпифитные бактерии в первую очередь ассоциированы с наземными растениями, непосредственно с филлосферой; аналогичные сообщества также формируются и на поверхностях водных растений (гидрофитов), где они адаптированы к повышенной влажности и аэробным условиям водной среды [Приходько, Селицкая, 2014]. В микробиологии водных эпифитов (перифитон) преобладают грамотрицатель-ные бактерии, такие как Pseudomonas , Aeromonas , Flavobacterium , Cyanobacteria , Bacillariophyta и Levadura , питающиеся выделениями растений и органическими соединениями водной фазы, описанные с середины XX в. как часть микробных биопленок, конкурирующих с патогенами и участвующих в круговороте азота и фосфора.

В 1903 г. К. Бари в русскоязычной литературе ввел термин «микрофлора надземных частей растений» для описания микроорганизмов на поверхностях растений, подчеркивая их роль в питании и защите. До 1980-х гг. этот термин доминировал в советской микробиологии, охватывая бактерии и грибы, живущие за счет экссудатов и пыли, без проникновения в ткани.

Beattie и Lindow (1999) назвали все бактерии листовых поверхностей «филлобактериями» ( phyllobacteria ), аналогично «ризобактериям» корневой зоны. Это стандартизировало терминологию для неинвазивных видов ( Pseudomonas syringae , Enterobacteriaceae ).

В 1960–1970-х гг. термин «эпифит» в микробиологии закрепился достаточно прочно, это совпало с исследованиями фитопатогенеза: ученые изучали антагонизм патогенов и силосование кормов. Эпифиты вроде Lactobacillus plantarum снижали pH, консервируя корм, и предотвращали гниение. С середины XX в. ранее преобладали синонимы «поверхностные микроорганизмы» или «филлосферная флора» [Мусин и др., 2022].

В работах Malvick и Moore (1988) представлено, что большинство эпифитных бактерий не вредят растению, т. к. составляют в большинстве своем нормальную микрофлору, на которой они обитают, но в некоторых случаях они могут быть как полезными, так и губительными. В качестве примера можно привести бактерии, которые способствуют образованию кристаллов льда. Такие места зарождения льда служат очагами образования льда на растениях при температуре намного выше обычной. Некоторые штаммы распространенных эпифитов, таких как Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas syringae и Pantoea agglomerans , обладают потенциалом зарождения льда, а представители Ps. syringae , как известно, являются фитопатогенными постоянными обитателями среди эпифитных популяций на травах и деревьях.

Lavermicocca и соавт. (1987) свидетельствуют о видоспецифичности эпифитных штаммов микроорганизмов, отмечая, что, помимо потенциала ледообразования, некоторые патогенные виды Pseudomonas , по-видимому, ассоциируются эпифитно на соответствующих растениях-хозяевах. На таких растениях, как олива и олеандр, часто встречается возбудитель оливкового узла Pseudomonas syringae pathovar savastanoi и другие псевдомонады, составляющие около 33 % популяции. Другие микроорганизмы эпифитного сообщества включают Bacillus (22 %) и Xanthomonas (10 %), а также меньшее количество представителей Acinetobacter , Erwinia , Serratia , Lactobacillus , Corynebacterium , Flavobacterium и неопознанные азотфиксаторы.

Ercolani (1978) составил список бактерий для листьев оливы, где основными эпифитными организмами были Pseudomonas syringae pathovar savastanoi и Erwinia herbicola. Такая тесная связь патогена в эпифитном состоянии может быть важна для его длительного выживания.

• S.S.    Hirano и C.D. Upper внесли уточнение в определение понятия: «Эпифитные микроорганизмы – это бактерии, способные размножаться на поверхности растений». Они подчеркнули динамику сообществ (10⁴–10⁷ кл/см²), конкурирующих с патогенами вроде Venturia или Alternaria [Hirano, Upper, 1991].

Beattie и Lindow [1995] разработали общую модель колонизации листьев эпифитными бактериями, которая выглядит следующим образом: иммиграция бактерий → модификация среды обитания → деление бактерий → образование микроколоний → образование крупных агрегатов → проникновение в пространства растения → модификация среды обитания и деление бактерий → миграция на поверхность листа.

Эти этапы будут отличаться у бактерий разных видов. Рассмотренная динамика колонизации и выживания в агрессивной среде филлосферы является основой для ключевого биотехнологически значимого свойства эпифитов – синтеза широкого спектра биологически активных соединений, среди которых особый интерес представляют вещества с антиоксидантной и антимикробной активностью.

Теоретический обзор

Успешная колонизация филлосферы по модели Beattie и Lindow [1995] обеспечивает эпифитам адаптацию к агрессивной среде, стимулируя синтез биологически активных метаболитов. Фитогормоны, которые, по данным B.R. Glick [2012], продуцируют PGPB (plant growth-promoting bacteria), ( Bacillus subtilis , Pseudomonas fluorescens ), включая гиббереллины – дитерпеновые регуляторы роста, прерывающие покой семян и стимулирующие цветение.

Glick в обзоре «Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications» [2012] описал бактерии, стимулирующие рост растений PGPB, включая эпифитов рода Bacillus subtilis , B. pumilus , licheniformis , B. megaterium , B. cereus , Pseudomonas fluorescens . Они фиксируют азот, синтезируют фитогормоны (ауксины, гиббереллины) и подавляют патогенов, продвигая устойчивое земледелие без химикатов.

Гиббереллины – группа дитерпеновых фитогормонов, стимулирующих рост стеблей и корней за счет деления и удлинения клеток, прерывающих покой семян, клубней и луковиц, способствующих формированию цветоносов, цветению, плодоношению, прорастанию пыльцы и образованию партенокарпии (бессемянных плодов у винограда, смородины, овощей).

Eiichi Kurosawa открыл гиббереллины при исследовании болезни риса «баканэ» (яп. «болезнь дурных побегов» или «бешеный рис»), вызываемой грибом Gibberella fujikuroi (современное название Fusarium fujikuroi или Fusarium proliferatum ). Заболевание проявлялось аномальным удлинением междоузлий стеблей риса, что приводило к их полеганию, слабому образованию колосьев и снижению урожайности; он также экспериментально доказал, что фильтрат культуры гриба, выращенного на питательной среде, воспроизводит симптомы «баканэ» на здоровых растениях риса. Это указало на наличие метаболита гриба – растворимого вещества, стимулирующего чрезмерный рост стеблей. Данные вещества он не выделил химически, но установил причинно-следственную связь между грибом и эффектом [Куросава, 1926].

В 1935 г. японский химик Тосифуми Ябута (Toshiro Yabuta) с коллегами из Токийского императорского университета выделил активное вещество из культуры Gibberella fujikuroi в химически чистом кристаллическом виде. В результате это позволило подтвердить химическую природу вещества, провести первые биотесты на рост, заложить основу для синтеза и промышленного применения [Ябута, Сумки, 1938].

В 1939–1950-х гг. в Японии, США и Европе выделили GA2–GA3 Gibberellin A2, дитерпеновый фитогормон (GA3 – наиболее активная гиббереллиновая кислота). Открытие гиббереллинов стало ключевым в фитогормонологии, связав патологию растений с регуляторами роста.

Zotz (2016) в обзоре качественного состава эпифитной микрофлоры отметил определенную степень однородности микробных сообществ. Среди наиболее распространенных представителей выделяется Pseudomonas herbicola (ранее Xanthomonas herbicola , син . Erwinia herbicola ) – короткие подвижные гра-мотрицательные палочки, образующие золотистые колонии на мясопептонном агаре (МПА).

Часто встречаются также Pseudomonas fluorescens – полиморфные палочки с полярными жгутиками, флуоресцирующие как в мясопептонном бульоне (МПБ), так и на МПА. Спороносные бактерии ( Bacillus subtilis , Bacillus mesentericus , Bacillus vulgatus ) и неспорообразующие ( Escherichia coli ) обнаруживаются реже, как и плесневые и дрожжевые грибы, а молочнокислые бактерии и дикие дрожжи рода Saccharomyces выступают первичными антагонистами гнилостных микроорганизмов ( Bacillus , Pseudomonas , Actinomyces , Fungi imperfecti ) [Сиротин, Зеленкова, Шкуропат, Кортюкова, 2016].

R.P. Bartelme и соавт. в 2018 г. ввели термин PGPM – микроорганизмы, стимулирующие рост растений (plant growth-promoting microorganisms) , в том числе в системах аквапоники. Эти микроорганизмы заселяют ризосферу, синтезируют фитогормоны, прежде всего гиббереллины, и тем самым ускоряют рост побегов, стимулируют прорастание семян, а также могут влиять на цветение и образование вегетативных органов, например, столонов [Bartelme et al., 2018].

В том же году Jimenez-Gomez и соавт. предложили понятие «пробиотики растений», под которым понимают микробные консорциумы, используемые для улучшения физиологического состояния растений и повышения качества продукции. Такие препараты могут включать представителей родов Enterobacter и Streptomyces.

R. Backer и соавт. подробно рассмотрели PGPR/PGPB ( plant growth-promoting rhizobacteria , широкая группа PGPR + эпифиты + эндрофиты обитающие на разных частях растения (корни, листья, стебли, внутри тканей)). PGPB (plant growth-promoting bacteria) , узкая группа, живущих в ризосфере (корневой зоне почвы), специфичны для корневой системы растений как биостимуляторы. Эти бактерии не только повышают урожайность, но и усиливают устойчивость растений к абиотическим и биотическим стрессам, а также участвуют в биоконтроле фитопатогенов. К числу наиболее изученных представителей этой группы относятся Bacillus , Pseudomonas , Azotobacter , Azospirillum и Rhizobium. Они обитают преимущественно в ризосфере, фиксируют азот, мобилизуют фосфаты и синтезируют антимикробные соединения, улучшая питание и защиту растений [Backer et al., 2018].

Эпифитные микроорганизмы занимают особую экологическую нишу и постоянно испытывают воздействие неблагоприятных факторов: колебаний влажности и температуры, дефицита питательных веществ, ультрафиолетового излучения и кислой среды. В ответ на это у них сформировались адаптационные механизмы, включая пигментацию, повышающую устойчивость к УФ-излучению, а также системы репарации ДНК. Например, у Pseudomonas syringae толерантность к ультрафиолету связывают с индукцией плазмидных генов, участвующих в восстановлении ДНК. Исследования эпифитной микробиоты земляники показывают, что изменение ее состава, например, рост доли патогенов вроде Cladosporium или, наоборот, полезных антагонистов, может служить индикатором стресса, болезней или нарушений в почвенной среде.

R. Schlechter и соавт. показали, что эпифитные микроорганизмы при колонизации растительных поверхностей формируют биологический барьер – так называемый первичный иммунитет, препятствующий проникновению патогенов в ткани. Большинство из них действует как антагонисты фитопатогенных и гнилостных бактерий и грибов, обеспечивая защиту растений от инфекций. Авторы рассматривают этот антагонизм не как случайное явление, а как результат сложных межмикробных взаимодействий в консорциуме, где конкуренция за ресурсы и пространство стимулирует синтез антибиотиков, а также отмечают перспективность управления эпифитной микрофлорой. Одним из эффективных методов усиления ее размножения и антагонистического действия против фитопатогенов является опрыскивание растений питательными растворами. Такой подход позволяет бороться с заболеваниями растений через целенаправленное воздействие на эпифитную микробиоту [Schlechter et al., 2019].

M.D. Gershman и соавт. [2008] отмечают, что некоторые виды бактерий признаны продуцентами витаминов, среди которых могут быть упомянуты молочнокислые бактерии, являющиеся эпифитами и способные к синтезу витаминов группы В. Кроме того, эти эпифиты известны своими антагонистическими свойствами, позволяющими им эффективно бороться с различными фитопатогенными грибами и бактериями посредством производства антибиотиков.

Именно благодаря этим свойствам эпифиты способны синтезировать широкий спектр биологически активных веществ, оказывающих влияние на рост и продуктивность растений. К числу таких микроорганизмов относятся бактерии рода Pseudomonas , широко распространенные на поверхности филлосферы древесных культур. Они способны продуцировать ауксины, гиббереллины, цитокинины, сидерофоры (пиовердин) и антибиотики (пиоцианин, пирролнитрин), стимулируя рост и защищая растения от патогенов [ibid].

• A. Horta и соавт. [2014] выделили и идентифицировали эпифитные бактерии с поверхности бурых водорослей Bifurcaria bifurcata , а также получили их экстракты для оценки антиоксидантной и антимикробной активности. Идентификацию эпифитных бактерий проводили методом секвенирования гена 16S рРНК, а затем получили 2 типа экстрактов – это метанольный (полярные соединения) и дихлорметановый (липофильные метаболиты) экстракты эпифитных бактерий, используемые для оценки их антиоксидантных и антимикробных свойств. Антиоксидантные свойства экстрактов определяли количественными

методами: по общему содержанию фенолов TPC (Total Phenolic Content) , активности поглощения радикалов DPPH и ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) , емкости поглощения кислородных радикалов. Антимикробную активность оценивали по влиянию экстрактов на тест-культуры: Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Bacillus subtilis , Salmonella enteritidis , Staphylococcus aureus , Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans .

В результате исследований бурой водоросли Bifurcaria bifurcata были выделены 39 эпифитных микроорганизмов, среди которых 33 были идентифицированы как представители родов Vibrio sp. , Alteromonas sp. , Shewanella sp. , Serratia sp. , Citricoccus sp. , Cellulophaga sp. , Ruegeria sp. и Staphylococcus sp. Штамм Shewanella sp. показал наивысшую антиоксидантную и антимикробную активность против Bacillus subtilis . Некоторые культуры Alteromonas sp . и Vibrio sp . проявили активность против S. Aureus . Данное исследование выявило значительный потенциал эпифитных бактерий Bifurcaria bifurcata в качестве источников природных антиоксидантных и антимикробных соединений [Horta et al., 2014].

• G. Romano и соавт. отмечают, что антиоксидантный и антибактериальный потенциал эпифитных микроорганизмов наиболее изучен на примере морских экосистем. Эпифитные сообщества морских водорослей признаны исключительно богатым источником новых антибиотиков благодаря жесткой конкуренции в условиях биообрастания. Это направление является наиболее разработанным среди современных исследований [Romano et al., 2022].

F.J. Adeolu и соавт. были изучены фитохимический состав и антиоксидантная активность экстрактов листьев апельсина Citrus sinensis (CS) и его эпифитной микрофлоры (CSE) in vitro (CSE – Citrus sinensis epiphytic microorganisms , микроорганизмы, выделенные с поверхности листьев апельсина). Фитохимиче-ский профиль экстрактов определяли методом ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография, HPLC (High Performance Liquid Chromatography )), а антиоксидантные свойства оценивали с помощью ряда спектрофотометрических тестов, включая DPPH, тест на нейтрализацию оксида азота, определение ингибирования перекисного окисления липидов и метод FRAP ( Ferric Reducing Antioxidant Power ). Эпифиты участвуют в круговороте питательных веществ и увеличивают разнообразие и биомассу экосистемы, в которой они обитают, как и любой другой организм. Например, эпифиты какао используются для лечения болезней сердца, эпифиты ореха кола – диабета, а эпифиты моринги – диабета и малярии [Adeo-lu et al., 2020].

Результаты метода ВЭЖХ, показали наличие в экстрактах CS и CSE ряда биологически активных соединений, в том числе эриоцитрина, кверцетогенина, тангеретин, гесперидина и флавоноидов. При этом в CSE наибольшее содержание было отмечено для эриоцитрина, а в CS – для тангеретин. В целом экстракт CS продемонстрировал более выраженный антиоксидантный потенциал по сравнению с CSE, что, вероятно, связано с более высоким суммарным содержанием фитохимических веществ.

Полученные данные указывают на то, что листья Citrus sinensis и их эпифитные микроорганизмы могут служить перспективным источником природных антиоксидантов. Такие соединения потенциально могут использоваться при разработке терапевтических средств и функциональных продуктов, предназначенных для профилактики и коррекции патологических состояний, связанных с окислительным стрессом [Sok Sian Liew, Wan Yong Ho, Swee Keong Yeap, Shaiful Adzni Bin Sharifudin, 2018].

• A. Sharma и соавт. отметили, что ключевым этапом оценки биологического потенциала эпифитов стало их прямое сравнение с эндофитами. В исследовании эпифитных и эндофитных бактерий лекарственных растений установлено, что антиоксидантная активность многих эпифитных изолятов не уступает эндофитным. При этом отдельные штаммы родов Pseudomonas и Bacillus дополнительно проявляют антимикробную активность. Эпифитная ниша является не менее перспективным объектом биопроспекции, чем эндофитная [Sharma et al., 2023].

A. Penesyan и соавт. показали, что эпифитные морские бактерии синтезируют защитные вещества, чтобы бороться с патогенами и не дать другим микробам заселить водоросли. Ключевой пример – тропо-дитиетиновая кислота (TDA) из Pseudovibrio sp. D323. TDA убивает морских бактерий разных групп, но сами продуценты устойчивы к ней (благодаря специальному механизму). TDA проявляет мощную антибиотическую активность с высоким потенциалом для разработки новых лекарственных препаратов, а не только антиоксидантных свойств. Выделенные эпифиты с водорослей у берегов о. Малый Андаман (Little Andaman) Bacillus sp. , Pseudomonas stutzeri , Vibrio , Alcanivorax dieselolei , Exiguobacterium profundum подавляют патогенных возбудителей (Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Shigella , Salmonella) – зоны ингибирования патогенных возбудителе до 30 мм. Они производят фуранопроизводные, 2-пирролидон и фенолы; минимальная концентрация (MIC) – 2.5 мг/мл. Оптимальные условия: среда с 1 % NaCl, глюкозой, дрожжевым экстрактом при pH = 7. На наземных растениях Pseudomonas и Erwinia herbicola создают барьер против фитопатогенов через антибиотики и конкуренцию за пространство [Penesyan, Kjelleberg, Egan, 2011].

Lemos и соавт. [1985] изучили антибиотические свойства бактерий, живущих на поверхности морских водорослей (эпифитных бактерий). Они взяли 5 видов зеленых и бурых водорослей (Ulva intestinalis, Enteromorpha intestinalis, Enteromorpha spp, Laminaria spp, Fucus spp), выделили 224 штамма бактерий и протестировали их на способность производить антибиотики. Из 224 штаммов 38 показали антимикробную активность – они подавляли рост других бактерий, как своих, так и чужих. Больше всего таких штаммов нашли на Enteromorpha intestinalis. Все активные бактерии относились к группам Pseudomonas и Alteromonas. Их антибиотики действовали на следующие патогены: Staphylococcus, Vibrio, Pseudomonas и Pasteurella.

Эпифитные бактерии ( Sphaerococcus coronopifolius ) на морских водорослях обладают мощной антиоксидантной активностью, защиту от свободных радикалов измеряли тестами ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) , DPPH ( 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ) – это метод улавливания радикалов, при котором стабильный фиолетовый свободный радикал теряет цвет (становится желтым) при контакте с антиоксидантами. Метод измеряет степень и скорость нейтрализации стабильного свободного радикала, где антиоксиданты восстанавливают его до нерадикальной формы. DPPH -тест подтверждает высокую радикальную активность экстрактов. Эта активность обусловлена высоким TPC – содержанием фенолов, которые продуцируют пигментированные Gammaproteobacteria ( Pseudoalteromonas , Vibrio , Shewanella ).

TPC – Total Phenolic Content (общее содержание фенольных соединений), ключевой показатель антиоксидантного потенциала растений и микроорганизмов. Пигментированные бактерии класса Gammaproteobacteria ( Pseudoalteromonas , Vibrio , Shewanella ) производят фенольные антиоксиданты с высоким потенциалом применения в медицине и косметике. В растительных системах они усиливают защиту хозяина, повышая ORAC – способность гасить пероксильные радикалы – основные агрессоры окислительного стресса в растениях; TEAC ( Trolox Equivalent Antioxidant Capacity ) определяет антиоксидантную активность экстрактов в эквивалентах тролокса по их способности нейтрализовать катион-радикалы ABTS [Pawar, Majeed, Pal, Singh, 2015].

Методы оценки антиоксидантной активности эпифитных бактерий позволяют количественно измерить их способность нейтрализовать свободные радикалы, восстанавливать окислители и предотвращать окислительный стресс. Эти подходы особенно важны для морских эпифитов на водорослях штаммов Sphaerococcus Sp2, Sp12, Sp23, Sp25, Sp27 и Sp4 , поскольку такие бактерии часто продуцируют пигменты, ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза) и метаболиты с антиоксидантными свойствами, защищающие хозяина от УФ-излучения и патогенов.

Для оценки антиоксидантной активности экстрактов эпифитных бактерий широко применяют спектрофотометрические, флуориметрические, кинетические и электрохимические методы. Чаще всего используют DPPH, ABTS, FRAP, TBARS-тесты и метод Folin – Ciocalteu, поскольку они просты в исполнении, относительно недороги и подходят для первичного скрининга образцов.

DPPH -тест основан на способности антиоксидантов восстанавливать стабильный свободный радикал DPPH, что сопровождается изменением окраски раствора с фиолетовой на бледно-желтую и снижением оптической плотности при 517 нм. По результатам анализа рассчитывают показатель IC50, т. е. концентрацию вещества, при которой ингибируется 50 % радикалов.

ABTS -тест основан на обесцвечивании радикал-катиона ABTS+, поглощение которого регистрируют при 734 нм; результат обычно выражают в процентах ингибирования или в эквивалентах Trolox. Этот метод удобен для оценки как водорастворимых, так и липофильных антиоксидантов.

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) – тест, который позволяет определить восстановительную способность экстракта по восстановлению ионов Fe³⁺ до Fe²⁺ в присутствии комплекса TPTZ (2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine; 2,4,6-три(2-пиридил)-s-триазин ); изменение окраски измеряют спектрофотометрически при 593 нм, а результаты нередко выражают в пересчете на Fe (II).

Метод TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances) применяют для оценки интенсивности перекисного окисления липидов: он основан на определении малонового диальдегида, образующего окрашенный комплекс с тиобарбитуровой кислотой.

Помимо спектрофотометрических методов, в исследованиях антиоксидантных свойств эпифитных бактерий также используют флуориметрические и кинетические подходы, которые позволяют отслеживать реакцию в реальном времени и особенно полезны при анализе слабых антиоксидантов. К таким методам относятся ORAC и HORAC. ORAC оценивается способность соединений защищать флуоресцентный зонд от окисления пероксильными радикалами, а HORAC – от воздействия гидроксильных радикалов, образующихся в реакциях, связанных с ионами металлов. Эти методы считаются более информативными для сложных биологических экстрактов, поскольку учитывают не только конечный результат, но и скорость протекания реакции.

Для более точного анализа также применяют электрохимические методы, в том числе амперометрию и вольтамперометрию. Они основаны на прямом измерении тока окисления антиоксидантов при заданном потенциале и особенно удобны для изучения фенольных и флавоноидных соединений. Такие подходы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, поэтому подходят для анализа чистых культур и очищенных экстрактов.

Качественная пробоподготовка обеспечивает достоверность анализа метаболитов эпифитных микроорганизмов. Экстракция метаболитов проводят ультразвуком или аппаратом Сокслета с использованием метанола/этанола (соотношение 1:10, 40°C, 30–60 мин). Культуральные жидкости центрифугируют при 8000 g, 10 мин. Для живых культур определяют активность ферментов, в частности супероксиддисмутазы (SOD) по замедлению восстановления нитроблющего тетразолия (NBT) до голубого формаза́на.

Сравнение ведут с контролями: Trolox (аналог витамина E), аскорбиновая кислота IC50 <100 мкг/мл = высокая активность. Штаммы Sphaerococcus Sp2, Sp12 показывают результаты в DPPH/FRAP благодаря пигментам (табл. 1) [Яшин, 2018].

Таблица 1

Критерии антиоксидантной активности эпифитных штаммов Sphaerococcus Sp2, Sp12, Sp23, Sp25, Sp27 и Sp4

[Criteria for antioxidant activity of epiphytic strains of Sphaerococcus Sp2, Sp12, Sp23, Sp25, Sp27 and Sp4 ]

Критерий	Высокая активность	Средняя активность	Низкая активность
DPPH IC50	<100 мкг/мл	100–500 мкг/мл	>500 мкг/мл
ABTS	>200 μmol TE/g	50–200 μmol TE/g	<50 μmol TE/g
FRAP	>500 μM Fe (II)/г	100–500 μM Fe (II)/г	<100 μM Fe (II)/г

Спектрофотометрические методы: DPPH -тест – IC₅₀ <100 мкг/мл указывает на высокую активность. Штаммы Sphaerococcus Sp2, Sp12 показывают превосходные результаты за счет пигментированных метаболитов. FRAP -тест – восстановление Fe³⁺ → Fe²⁺ с 2,4,6-три(2-пиридил)-s-триазином (TPTZ). ABTS -тест – улавливание катион-радикалов ABTS - +. Показатели DPPH, FRAP сильно коррелируют (r >0.9) с содержанием фенолов/флавоноидов у Bacillus и Pseudomonas .

Хроматографические методы: ВЭЖХ – профилирование полифенолов и пигментов. Амперометрия – потенциал окисления <0.5 В свидетельствует о высокой активности.

Биохимические методы: TBARS – ингибирование ПОЛ, контроль FeSO₄ и 1,1,3,3-тетраэтоксипропан. SOD – супероксиддисмутаза по замедлению восстановления NBT до формазана.

Критерии отбора:

• •    AOA >50-100 μmol TE/g (эквиваленты Trolox);

• •    Снижение окислительного стресса растений на 30-50%;

• •    Полевое применение: 10⁹ КОЕ/г в биопрепаратах.

Результаты выражают в эквивалентах стандарта (μmol TE/g или мМ) (табл. 2) [Козубенко, Рудакова, 2018].

Таблица 2

Контрольные стандарты методов антиоксидантной активности [Control standards for antioxidant activity methods]

Метод	Контрольные стандарты	Единицы измерения
DPPH	Trolox, аскорбиновая кислота	IC50 (мг/мл), % ингибирования
ABTS (TEAC)	Trolox	мМ TE, % ингибирования
FRAP	FeSO 4 ·7H 2 O	мкМ Fe (II)/г
ORAC	Trolox	мкмоль TE/g

Кулонометрия позволяет прямо измерять антиоксидантную активность (АОА) по электрическому току, возникающему при окислении антиоксидантов на электроде, калибруя по троксолу в диапазоне 0,044–0,330 мМ, измеряя заряд (Кулон), необходимый для полного окисления антиоксидантов; это напрямую отражает их концентрацию без спектрофотометрии. Метод надежен для бактериальных экстрактов (±10–15% СКО при Ph 4–7), превосходит FRAP по чувствительности (LOD 0,01 мМ) и минимизирует помехи от пигментов. Для TBARS или ORAC комбинируют с амперометрией, где потенциал окисления (<0,5 В) подтверждает высокую активность.

Обеспечение воспроизводимости – это бактериальный экстракт (Bacillus , Pseudomonas) , стандарты калибруют кривыми (R² >0.99), проверяя ±15% СКО в 3–5 повторностях; это учитывает матричные эффекты (белки, соли). Рекомендуют нормализацию к сухому весу или CFU, хранение при –80°C и параллельный контроль (FeSO 4 для FRAP). В селекции штаммов это позволяет сравнивать АОА >100 μmol TE/g для биоконтроля.

Заключение

Анализ мирового опыта, накопленного к настоящему моменту, позволяет выявить несколько ключевых моментов в исследовании антиоксидантного и антимикробного потенциала эпифитов. Во-первых, наметился очевидный сдвиг от исследований наземных филлосфер к морским экосистемам, где наблюдается высокий уровень биоразнообразия эпифитных бактерий макроскопических водорослей. Это объясняется жесткой конкуренцией в биоценотических сообществах «водоросль - эпифит».

Во-вторых, актуальным направлением становится прямое сравнительное изучение метаболического потенциала эндо- и эпифитных сообществ в рамках одного растения-хозяина. Работы последних лет (например, [Sharma et al., 2023]) демонстрируют, что эпифитные изоляты с поверхности лекарственных растений могут не уступать, а по некоторым параметрам (например, по разнообразию синтезируемых фенольных соединений) даже превосходить эндофитные, что опровергает устоявшееся представление о вторичности эпифитной ниши.

В-третьих, методология исследований эволюционирует от простого скрининга к комплексному метабо-ломному и геномному анализу. Определение конкретных биоактивных молекул, секвенирование генов 16S рРНК для точной идентификации и поиск BGCs ( Biosynthetic Gene Clusters ) биосинтетических кластеров генов становятся стандартом, позволяя перейти от констатации активности к пониманию ее молекулярных основ. Таким образом, современный этап характеризуется переходом к целенаправленному изучению эпифитов как самостоятельного и высокоперспективного ресурса, чему способствует конвергенция методов микробной экологии, биохимии и молекулярной биологии.

Следовательно, эпифитные микроорганизмы обладают выраженным антиоксидантным и антибактериальным потенциалом, который может быть использован в различных отраслях – от медицины до пищевой промышленности.