Антитела к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону у больных раком молочной железы в постменопаузе

Проблема профилактики рака молочной железы (РМЖ) остаётся актуальной в связи с повсеместным ростом заболеваемости [1]. В настоящее время для первичной профилактики РМЖ применяются тамоксифен, ралоксифен и другие селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (ER) [2]. Для повышения их эффективности необходимо определить риск возникновения ER+ РМЖ у здоровой женщины. В геноме человека обнаружены локусы (12q24, rs1292011 и 21q21, rs2823093), ассоциированные с ER+ РМЖ, однако соответствующие белковые продукты не идентифицированы [3]. Анализ полиморфных вариантов генов BRCA [4], ферментов метаболизма ксенобиотиков и стероидных гормонов [5–7], ферментов репарации ДНК [8, 9] не позволяет определить индивидуальный риск возникновения ER+ РМЖ.

Ведутся экспериментальные разработки новой стратегии профилактики онкологических заболеваний, основанной на использовании канцероген-специфических антител (АТ). In vitro доказано, что АТ способны тормозить канцерогенез за счёт ограничения проникновения химических канцерогенов из окружающей среды в клетки поверхностного эпителия и угнетения метаболической активации канцерогенов [10, 11]. In vivo иммунизация животных конъюгатами химических канцерогенов с белками или ДНК сопровождается угнетением их проникновения из окружающей среды в организм и торможением возникновения индуцированных опухолей [12–19]. Кроме того, активная иммунизация животных против эстрогенов приводит к изменениям их концентрации в крови и тормозит рост эстроген-чувствительных опухолей [20, 21].

Между тем знания об особенностях образования АТ к химическим канцерогенам окружающей среды и эндогенным стероидным гормонам в естественных условиях у человека крайне ограничены. Ранее АТ против полициклических ароматических углеводородов и их аддуктов с ДНК были обнаружены в сыворотке крови человека [22–25]. АТ к этим канцерогенам и половым стероидам обнаружены у больных РМЖ [26, 27]. Одновременное повышение уровней АТ класса G, специфичных к бензо[a]пирену (БП), эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ), встречалось значительно чаще у больных РМЖ, чем у здоровых женщин [28]. Однако взаимосвязи АТ с ER+ РМЖ не было выявлено. В то же время предполагается, что АТ класса А способны стимулировать трансформацию ER+ клеток за счет связывания канцерогенов и ЭС и усиления их транспорта в эпителиальные клетки [29].

Цель исследования – изучение ассоциации АТ класса А, специфичных к БП, ЭС и ПГ с ER+ РМЖ.

Материал и методы

В исследование включены 672 некурящие женщины в постменопаузе, из них у 469 была диагностирована инвазивная карцинома молочной железы, эти пациентки получали лечение в условиях Областного клинического онкологического диспансера г. Кемерово. Диагноз РМЖ в каждом случае был подтвержден морфологически. Информация о гормон-рецепторном статусе опухолей была взята из протоколов патоморфологического отделения. Средний возраст больных РМЖ составил 62,6 ± 8,7 года. В группу сравнения были включены 203 здоровые женщины без патологии молочной железы (средний возраст – 58,9 ± 5,8 года).

Забор периферической крови осуществлялся согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003. Все лица, участвовавшие в исследовании, дали на это информированное письменное согласие.

Исследование АТ класса А к БП, ЭС и ПГ проводили с помощью неконкурентного иммунофер-ментного анализа в собственной модификации [22]. В качестве антигена на полистирольные иммунологические планшеты были иммобилизованы конъюгаты БП, ЭС и ПГ с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Конъюгат ЭС-БСА был синтезирован путем присоединения БСА к эстрадиолхи-нонам, полученным окислением ЭС солью Фреми. Конъюгат ПГ-БСА был получен путем конъюгации гемиглутарата 21-гидроксипрогестерона и БСА карбодиимидным способом. Иммунологические планшеты сенсибилизировали в течение ночи при комнатной температуре. Образцы сыворотки крови в разведении 1:20 вносили по 100 мкл в лунки планшета в дублях, инкубировали 1 ч при 37°С на шейкере. Cвязавшиеся АТ выявляли с помощью козьих АТ против IgA человека, меченных пероксидазой хрена (Novex, США), разведение конъюгата 1:10000. Регистрацию адсорбированных на планшете АТ проводили с помощью субстратного буфера, содержащего тетраметилбензидин (TMB, США), на фотометре (Пикон, Россия) при длине волны 450 нм. Уровни АТ к гаптенам выражали в относительных единицах и вычисляли по отношению связывания АТ с конъюгатом гаптен-БСА (за вычетом фонового связывания с БСА) к БСА.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Ненормальный характер распределения показателей определили с помощью критерия Шапиро–Уилка и в дальнейшем статистически значимые различия между группами выявляли с помощью U-критерия Манна–Уитни при уровне значимости p<0,05 и непараметрического критерия χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность вариации. При расчете критерия χ2 исследуемые признаки группировались в четырехпольную таблицу (d.f.=1). За критический уровень значимости принималось значение p<0,05. Ассоциации исследуемых АТ с РМЖ оценивали с помощью величины отношения шансов (ОR) с доверительным интервалом (CI) при 95 % уровне значимости. Для выявления пороговых значений уровней АТ (cutoff) был проведен ROC-анализ [30]. Взаимосвязи между уровнями исследуемых АТ были оценены с помощью ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Пограничные значения уровней IgA-БП, IgA-ЭС и IgA-ПГ, по которым здоровые женщины и больные РМЖ имели наиболее значимые различия, были определены с помощью ROC-анализа. Высокие уровни IgA-БП (>3) и IgA-ЭС (>3) в общей группе больных РМЖ (40,3 % и 43,1 %) обнаруживались значительно чаще, чем у здоровых (22,2 % и 29,9 % соответственно). При этом OR возрастал до 2,4 и 1,8 соответственно. Пограничное значение IgА-ПГ оказалось равным 3, однако статистически значимой разницы между сравниваемыми группами по этому показателю выявить не удалось, и OR оставался в пределах 0,7–1,5.

Принимая во внимание то, что в каждом индивидуальном случае образование АТ одной специфичности может происходить при отсутствии АТ другой специфичности, был выполнен анализ 8 возможных сочетаний высоких и низких уровней АТ к БП, ЭС и ПГ у здоровых женщин и больных РМЖ (таблица). Выяснилось, что отсутствие или низкие уровни IgA ко всем трём исследуемым гаптенам (комбинация 1) при РМЖ встречается значимо реже, чем в группе сравнения, – 42,4 % против 53,2 %, OR снижается до 0,6. Далее сопоставляли число случаев с высокими уровнями таблица

Частота встречаемости высоких уровней антител к бензо[a]пирену (igа-БП), эстрадиолу (igа-Эс) и прогестерону (igа-ПГ) у здоровых женщин и больных рМж в зависимости от рецепторного статуса

Комбинации антител	Здоровые женщины (n=203)	Больные РМЖ (n=469)	Больные РМЖ ER– (n=125)	Больные РМЖ ER+ (n=344)
1. IgА-БП ≤3	108 (53,2 %)	199 (42,4 %)	59 (47,2 %)	140 (40,7 %)
IgА-ЭС ≤3		p=0,01	p=0,35	p=0,005
IgА-ПГ ≤3		0,6 (0,5–0,9)		0,6 (0,4–0,9)
2. IgА-БП >3	7 (3,4 %)	29 (6,2 %)	9 (7,2 %)	20 (5,8 %)
IgА-ЭС ≤3		0,09	p=0,17	p=0,11
IgА-ПГ ≤3
3. IgА-БП ≤3	10 (4,9 %)	41 (8,7 %)	13 (10,4 %)	28 (8,1 %)
IgА-ЭС >3		p=0,04	p=0,08	p=0,06
IgА-ПГ ≤3		2,2 (1,1–4,6)
4. IgА-БП ≤3	20 (9,9 %)	21 (4,5 %)	5 (4,0 %)	16 (4,7 %)
IgА-ЭС ≤3		0,13	p=0,19	p=0,24
IgА-ПГ >3
5. IgА-БП >3	5 (2,5 %)	28 (6,0 %)	8 (6,4 %)	20 (5,8 %)
IgА-ЭС >3		p=0,03	p=0,11	0,04
IgА-ПГ ≤3		3,0 (1,1–8,1)		3,1 (1,1–8,5)
6. IgА-БП >3	8 (3,9 %)	18 (3,8 %)	4 (3,2 %)	14 (4,1 %)
IgА-ЭС ≤3		0,81	p=0,86	p=0,67
IgА-ПГ >3
7. IgА-БП ≤3	20 (9,9 %)	19 (4,1 %)	4 (3,2 %)	15 (4,4 %)
IgА-ЭС >3		0,07	p=0,11	p=0,18
IgА-ПГ >3
8. IgА-БП >3	25 (12,3 %)	114 (24,3 %)	23 (18,4 %)	91 (26,5 %)
IgА-ЭС >3		p=0,0004	p=0,15	p=0,0001
IgА-ПГ >3		2,5 (1,5–4,0)		2,8 (1,7–4,7)

исследуемых АТ в различных комбинациях (2–8) с комбинацией 1. Не было выявлено значимых различий между здоровыми женщинами и больными РМЖ по частоте встречаемости высоких уровней IgA-БП (комбинация 2) или IgA-ПГ (комбинация 4). Высокие уровни IgA-ЭС (комбинация 3) у больных РМЖ (8,7 %) встречались чаще, чем у здоровых (4,9 %, р=0,04), при этом значение OR возрастало до 2,2. Одновременное повышение уровней IgA-БП и IgA-ЭС (комбинация 5) у больных РМЖ (6,0 %) встречалось значимо чаще, чем у здоровых (2,5 %, р=0,03). По частоте обнаружения IgA-БП или IgA-ЭС совместно с IgA-ПГ (комбинации 6 и 7) сравниваемые группы не отличались. Индивидуальное сочетание высоких уровней всех трех исследуемых АТ (комбинация 8) обнаружено с большей частотой у больных РМЖ (24,3 %), чем у здоровых (12,3 %). В сравнении с комбинацией 1 – р=0,0004, OR=2,5. Сравнение частоты обнаружения указанных комбинаций (1–8) у больных ER– РМЖ со здоровыми женщинами не выявило значимых различий. В то же время отсутствие всех трех исследуемых АТ (комбинация 1) у больных ER+ РМЖ (40,7 %) встречалось значимо реже, чем у здоровых (53,2 %), с р=0,005 и OR=0,6. Одновременное повышение уровней IgA-БП и IgA-ЭС (комбинация 5), а также IgA-БП, IgA-ЭС и IgA-ПГ (комбинация 8) у больных ER+ РМЖ обнаружено с большей частотой, чем у здоровых (5,8 % против

2,5 % и 26,5 % против 12,3 % соответственно). В последнем случае р=0,0001, OR=2,6. Больные ER– и ER+ РМЖ не отличались друг от друга по частоте обнаружения в комбинациях 1–7. В то же время одновременное повышение уровней всех трех исследуемых АТ (комбинация 8) обнаруживали чаще у больных ER+ (26,5 %), чем у ER– РМЖ (18,4 %), с р=0,0001 и OR=2,8.

Таким образом, отсутствие АТ класса А, специфичных к БП, ЭС и ПГ, ассоциировано с пониженным риском ER+ (OR=0,6), но не ER– РМЖ. Одновременное повышение уровней IgA-БП и IgA-ЭС или IgA-БП, IgA-ЭС и IgA-ПГ ассоциировано с высоким риском ER+ (OR=3,1 и 2,8 соответственно), но не ER– РМЖ. Иммуноанализ указанных АТ может оказаться полезным в определении показаний для превентивного использования селективных ингибиторов эстрогеновых рецепторов с целью профилактики РМЖ у женщин в постменопаузе.

Обращает на себя внимание тот факт, что каждое исследуемое АТ по отдельности (комбинации 2–4) встречается в небольшом количестве случаев как у здоровых, так и у больных РМЖ (не более 10 %). Вместе с тем одновременное повышение уровней АТ всех трех специфичностей (комбинация 8) у больных ER+ РМЖ достигает 26,5 %. Это свидетельствует о том, что индукция IgA-БП может быть взаимосвязана с индукцией IgA-ЭС и IgA-ПГ.

Рис. 1. Взаимосвязи уровней IgA-ЭС (у) и IgA-БП (х) у здоровых женщин (А) и больных ER+ РМЖ (Б)

И действительно, между уровнями IgA-БП, с одной стороны, и IgA-ЭС и IgA-ПГ, с другой стороны, обнаружены прямые линейные корреляционные связи средней силы как у здоровых женщин, так и у больных РМЖ (и ER+ и ER–) с коэффициентами корреляции rs=0,54–0,7 с р<0,0001. На рис. 1 приведен пример обнаруженных корреляций между IgA-ЭС (у) и IgA-БП (х) у здоровых женщин (А) и больных ER+ РМЖ (Б).

Таким образом, при стимуляции синтеза секреторных IgA против БП с профилактической целью вполне вероятно может повышаться уровень сывороточных IgA-БП. В свою очередь, это может повлечь за собой индукцию IgA-ЭС и IgA-ПГ, которые в комбинации с IgA-БП могут не тормозить, а стимулировать возникновение ER+ РМЖ. Поэтому стратегия активной иммунопрофилактики рака у человека за счет стимуляции антиканцерогенного иммунитета, предлагаемая некоторыми авторами [15-17, 19, 31], нуждается в дополнительной проверке. В частности, при иммунизации животных конъюгатами химических канцерогенов с макромолекулярными носителями необходимо контролировать синтез АТ, специфичных не только к канцерогенам, но и к эндогенным стероидам.

Заключение

В канцерогенезе рака молочной железы принимают участие две основные группы факторов: внешние – химические канцерогены (в том числе полициклические ароматические углеводороды, БП) и внутренние – стероидные гормоны. Поэтому в разработке информативных методов определения риска РМЖ необходимо учитывать их совместное воздействие на клетки-мишени. Этому условию соответствует исследование специфических иммунных реакций на указанные химические соединения.

В работе показано, что образование АТ, специфичных к БП, ЭС и ПГ, – взаимосвязанные процессы. Уровни IgA-ЭС и IgA-ПГ коррелируют с уровнями IgA-БП с высокой статистической значимостью (p<0,0001). Одновременное повышение уровней указанных АТ ассоциировано с ER+ РМЖ (p<0,0001; OR=2,8), но не с ER– РМЖ. Таким образом, комплексный иммуноанализ АТ против химических канцерогенов окружающей среды и половых стероидных гормонов можно рассматривать как перспективный метод в определении показаний для превентивного назначения тамоксифена и других селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов. В то же время активная стимуляция антиканцерогенного иммунного ответа с целью профилактики РМЖ может сопровождаться повышением уровня АТ, специфичных к стероидным гормонам, и возрастанием риска возникновения РМЖ. Очевидно, для защиты человека от воздействия химических канцерогенов потребуются иные методические подходы.