Антитромботическая и тромболитическая активность соединения SBT-119 на модели in vitro

В настоящее время в клинической практике наиболее распространены антиагрегантные препараты: блокаторы P2Y12-рецепторов — тиклопидин, клопидогрель, прасугрель, тикангрелор, кангрелор, элиногрель и ингибиторы циклооксигеназного пути агрегации тромбоцитов — ацетилсалициловая кислота [1, 2, 6, 7]. Наличие ряда недостатков у данных лекарственных средств (развитие резистентности при длительных курсах лечения, позднее наступление основного терапевтического эффекта, повышение риска кровотечений различного генеза, нейтропения, тромбоцитопения, аллергические реакции и другие [6]), а также особенность их ме- ханизма действия (влияние на конечную стадию необратимой агрегации тромбоцитов) свидетельствует об актуальности поиска новых веществ с антиагрегантной и антитромботической активностью.

К настоящему времени имеется множество экспериментальных данных о новой перспективной мишени для создания антиагрегантных и антитромботичес-ких средств — блокаторов P2Y1-рецепторов. Именно подавление активности данного подтипа пуриновых рецепторов на мембране тромбоцитов предотвращает активацию и последующую агрегацию тромбоцитов на начальной стадии, когда процесс обратим [2, 5, 6]. Это объясняет актуальность выявления и изучения свойств новых соединений с пуринергической антагонистической активностью как потенциальных корректоров функциональной активности тромбоцитов при нарушениях гемостаза. В ранее проведенных исследованиях по изучению активностей веществ было установлено, что соединение производное индола Sbt-119 на обогащенной тромбоцитами плазме проявляет Р2Y1-антагонистическую, антиагрегантную активности в условиях in vitro и ex vivo [3, 4].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование влияния соединения Sbt-119 на время окклюзии и лизиса цельной крови крыс in vitro .

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние веществ на время окклюзии и лизиса цельной крови крыс изучалось по методу Goroga D. A. [8] на приборе «Global Thrombosis Test» (Montrose Diagnostics Ltd, UK), имитирующем механическую модель тромбообразования in vitro , равнозначную патофизиологической окклюзии. Этот процесс относят к одному из звеньев патогенеза атеросклеротического процесса периферических сосудов, диабетической ангиопатии, тромбоза коронарных артерий, пристеночного тромбоза в полостях сердца, периферической тромбоэмболии, тромбоза вен нижних конечностей, легочной тромбоэмболии и т. д.

Принцип метода заключается в том, что при прохождении крови (37 оС) через узкое пространство между большим шариком и внутренней стенкой трубки, под действием высокого напряжения, происходит активация тромбоцитов.

При достижении током крови пространства между большим и маленьким шариками за счет турбулентности запускаются процессы агрегации (выделение АДФ и тромбоксана-А2) и коагуляция (синтез тромбина), приводящие в конечном итоге к окклюзии (рис.) [9]. Для усиления пуринового механизма активации тромбоцитов в пробирку предварительно вносится раствор АДФ [8].

Соединение Sbt-119 и препараты сравнения клопидогрель («Sanofi-syntelabo», Франция) и тикло-пидин («Sanofi-syntelabo», Франция) изучались в эквимолярных дозах, соответствующих средней терапевтической дозе тиклопидина — 6 мг/кг. Вещества вводились перорально за два часа до эксперимента. Контрольная группа получала дистиллированную воду в эквивалентных объемах. Животных наркотизировали хлоралгидратом при внутрибрюшинном введении в дозе 400 мг/кг. Забор крови крыс, в объеме 2 мл, из брюшной аорты проводили непосредственно перед внесением проб в пробирку. АДФ использовали в концентрации 5 mM.

Антитромботическую и тромболитическую активности веществ оценивали по времени окклюзии (OT, с) и лизиса (LT, с) соответственно. Статистическая обработка данных проводилась с использованием критерия Краскелла-Уолиса с постобработкой тестом Данна для множественных сравнений в программе «Graph. Pad. Prism. 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ данных о времени окклюзии показал, что клопидогрель достоверно по отношению к контролю снижал скорость тромбообразования в 1,8 раз. Второй препарат сравнения, тиклолпидин, оказался менее активным, незначительно, статистически недостоверно, увеличивал время развития окклюзии.

По степени подавления процесса тромбообра-зования Sbt-119 в 2,1 и 1,9 раза превосходил контроль и препарат сравнения тиклопидин соответственно ( р < 0,05). При сопоставлении данных о влиянии на показатель «время окклюзии» опытного вещества к клопидогрелю было отмечено, что соединение Sbt-119 проявляет более активное антитромботическое действие (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1

Влияние соединения Sbt-119

и препаратов сравнения на время окклюзии в образцах цельной крови крыс in vitro (m ± M)

Соединение	Количество проб	Время окклюзии (OT), с
Контроль	6	46,30 ± 8,71
Sbt-119	6	97,60 ± 12,43*,#
Клопидогрель	6	86,80 ± 5,24*
Тиклопидин	6	50,20 ± 9,47

*Статистически значимые отличия относительно контроля;

^#статистически значимые отличия относительно тиклопидина (критерий Краскелла-Уолиса, р < 0,05).

Вероятно, эти различия связаны с механизмом действия опытного вещества и препаратов сравнения. Так, тиклопидин и клопидогрель реализуют антитромбоген-ную активность посредством блокирования процесса АДФ-индуцированной агрегации. То есть они не влияют на один из пусковых механизмов окклюзии — активацию тромбоцитов [2]. Опытное соединение Sbt-119, как показали проведенные исследования, подавляет АДФ-опосредованную и активацию, и агрегацию [4].

Проведение анализа полученных результатов по влиянию вещества Sbt-119 и препаратов сравнения на «время лизиса» показало, что все соединения практически не влияли на данный показатель (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2

Влияние соединения Sbt-119

и препаратов сравнения на время лизиса цельной крови крыс in vitro ( m ± M )

Соединение	Количество проб	Время лизиса (LT), с
Контроль	6	1481,8 ± 273,2
Sbt-119	6	1549,0 ± 102,4
Клопидогрель	6	1520,80 ± 43,92
Тиклопидин	6	1579,70 ± 55,31

Это имеет важное значение, так как для большинства используемых в настоящее время антиагрегантных и антитромбоцитарных препаратов характерно наличие такого осложнения, как повышение риска кровотечений, что связано, в том числе, с их фибринолитическим действием [10].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Соединение Sbt-119 проявляет антитромботичес-кую активность, что подтверждается достоверным увеличением времени наступления окклюзии в сравнении с контролем и тиклопидином в среднем в 2 раза. Установлено, что данное вещество по силе подавления образования агрегатов тромбоцитов статистически недостоверно превосходит и клопидо-грель. При этом Sbt-119 не оказывает влияния на фибринолитическую функцию крови.