Апробация метода изотопного анализа кислорода зубной эмали для реконструкции сезонности рождения Ovicaprine

Определение сезонности рождения мелкого рогатого скота дает возможность воссоздать использовавшиеся стратегии скотоводства. Известно, что для увеличения поголовья скота человеком часто искусственно создаются условия для оката овец дважды в год (весной и осенью). Исследования, проведенные М. Балассе с коллегами, показывают, что эта практика применялась в период ранней доместикации овец в Южной Африке, юго-западе Франции и западном Средиземноморье [Balasse et al., 2003, p. 205; Blaise, Balasse, 2011, p. 3085; Tornero et al., 2020, p. 12798]. Данное направление исследований актуально для выяснения хронологии ранних этапов скотоводства, окат мелкого рогатого скота дважды в год является одним из самых достоверных признаков контроля человека над стадом [Hermes et al., 2022, p. 792].

Изотопный анализ кислорода в образцах зубной эмали, отобранной последовательно вдоль линии роста коренных зубов, с учетом времени прорезывания зубов и полного созревания эмали позволяет реконструировать сезонность рождения мелкого рогатого скота [Balasse et al., 2012, p. 349]. Для определения сезонности рождения используются моляры М2 и М3, завершение прорезывания которых происходит в ок. 1,3 и 2,4 года животного соответственно [Geiger et al., 2020, p. 273]. Изотопный состав кислорода в зубной эмали зависит в первую очередь от изотопного состава воды, поглощаемой животным непосредственно из водоемов, а также с растительной пищей, и таким образом опосредованно отражает климатические факторы в местности пребывания животного во время формирования эмали [Pederzani, Britton, 2019, p. 77]. При наличии сезонности климата в изучаемой местности наблюдаются циклические вариации δ18O вдоль линии роста зуба: максимумы кривых соответствуют летнему периоду, минимумы – зимнему.

Зубная эмаль на 96 % состоит из гидроксиапатита Ca10(PO4)6(OH)2, в котором гидроксильные группы и фосфат-ионы частично замещены на карбонат-ионы [Ressler et al., 2021, p. 100]. Во всех немногочисленных исследованиях с применением изотопного анализа последовательно отобранных проб зубной эмали мелкого рогатого скота анализируются карбонаты, составляющих всего 4 % гидроксиапатита по массе.

Для получения надежных результатов по δ18O в зуб- ной эмали образцов разного возраста и сохранности наибольший интерес вызывает анализ соотношений изотопов кислорода в фосфатах, поскольку: 1) эмаль почти на 90 % состоит из фосфатов; 2) кислород в фосфатных группах более устойчив к процессам диагенеза в сравнении с кислородом в карбонатах. Работы по изотопному анализу фосфатов, выделенных из последовательно отобранных образцов эмали животных, пока немногочисленны. Были обнаружены циклические изменения δ18O в фосфатных группах гидроксиапатита вдоль линии роста моляров M2, M3 бизонов [Bernard et al., 2009, p. 133], M3 вилорогов [Fraser et al., 2021, p. 17005], M2 лошадей [Fabre et al., 2011, p. 605]. Для анализа фосфатов требуется многостадийный процесс выделения Ag3PO4 из зубной эмали.

В рамках данной работы предложен новый метод изотопного анализа кислорода в зубной эмали для определения сезона рождения мелкого рогатого скота, не требующий многостадийной химической пробо-подготовки. Для анализа соотношений изотопов кислорода использована современная методика, основанная на восстановлении компонентов эмали углеродом до CO непосредственно в элементном анализаторе, который используется в тандеме с изотопным масс-спектрометром.

Материалы и методы исследования

Для апробации методики определения сезона рождения мелкого рогатого скота в августе 2022 г. в окрестностях пос. Шак-Шак близ г. Айдар-кен (южный Кыргызстан) были отобраны две челюсти Ovicaprine. Для изотопного анализа кислорода эмали были использованы коренные моляры M1 и M2. Поселок Шак-Шак располагается в северных склонах Алайского хребта, вблизи от ущелья Гауян (Гави-ан), на высоте 2 000 м над ур. м., в непосредственной близости г. Айдаркен. Данный регион характеризуется резко континентальным климатом с выраженной и снежной зимой, средние температуры зимой составляют от –15 до –20 градусов, летом – от +25 до +30 градусов. Местное население занимается преимущественно сельским хозяйством, используется отгонное скотоводство овец и коз, также в регионе разводят коров и лошадей. Из агрокультур здесь выращивают ячмень, пшеницу, кукурузу, картофель и разводят плодовые деревья, такие как яблони, урюк, грецкий орех.

Зачистку и напил зубной эмали всех зубов производили с помощью гравера (Dremel) и набора фрез. Напил эмали выполняли со щечной стороны зуба от шейки до кончика перпендикулярно оси роста зуба с шагом от 2 до 4 мм, глубиной ок. 1 мм.

Порошки образцов взвешивали по 800–1000 мкг на аналитических весах высокой точности с ценой деления 10^-6 г (ME36S, Sartorius) и запечатывали в специальные серебряные капсулы. Непосредственно перед анализом образцы помещали в карусель автосамплера HCNS-анализатора FLASH 2000 (Thermo Scientific). Анализ стабильных изотопов ¹⁸O/¹⁶O проводили при помощи двух приборов: НСNS-анализатора FLASH 2000 (Thermo Scientific) в режиме пиролиза и газового изотопного масс-спектрометра «Delta V Advantage». В качестве стандарта для измерения ¹⁸O/¹⁶O использовали внутренний стандарт SURCAL: δ¹⁸O_VPDB= –8,51 ‰. Отношения ¹⁸О/¹⁶О представляли относительно международного стандарта, кальцита ростра белемнита (PDB) из верхнемеловой формации Пи-Ди (Южная Каролина, США), в виде: δ¹⁸O_VPDB = = (R_exp/R_st–1)·1000, где R_exp и R_st – это отношение 18 O/ 16 O в исследуемом веществе и стандарте соответственно; δ-величины выражаются в промилле (‰).

Результаты и обсуждения

Новый стандарт для изотопного анализа кислорода: кальцит с памятника Cурунгур

На памятнике Сурунгур было обнаружено месторождение кальцита (рис. 1, а). Получены результаты изотопного анализа предварительно перемолотого и прокаленного кальцита с памятника Сурунгур – SURCAL и импортного кальцита – IAEA-603 (рис. 1, б). Для серий обоих образцов характерно одинаковое среднеквадратичное отклонение, составляющее 0,6 ‰. Таким образом, высокое качество кальцита с памятника Сурунгур позволяет использовать его в качестве внутреннего стандарта для изотопного анализа кислорода. Значение δ18OVPDB для SURCAL (δ18OVPDB = –8,51 ‰) определяли относительно IAEA-603 (δ18OVPDB = –2,37 ‰). Для изотопного анализа кислорода в зубной эмали Ovicaprine далее использовали SURCAL (рис. 1).

Описание челюстей и зубов современных Ovicaprine

Челюсти обеих особей содержат молочные премоляры dp2, dp3, dp4, а также коренные моляры M1 и M2. В челюсти особи 1 имеются молочные резцы с признаками истирания, моляра М3 не обнаружено (рис. 2). Поскольку смена центральных молочных резцов происходит в 15 месяцев, а премоляров – в 17 месяцев, животные погибли ранее 17 месяцев [Silver, 1963, p. 283]. На рисунке (рис. 3) представлены фотографии исследуемых зубов после напила образцов эмали с разных ракурсов. Отсутствие признаков истирания жевательных поверхностей моляров M1 и M2 и открытость апикальных отверстий корней указывают на возраст гибели животных менее 15 месяцев [Клевезаль, 2007]. Видно, что моляр M2 особи 2 полностью сформирован, его длина превышает длину M1 на 6 мм. Поскольку M2 формируется ок. 12 месяцев, возраст гибели особи 2 лежит в диапазоне 12–15 месяцев. Моляр M2 особи 1 находится в процессе прорезывания, в области шейки зуба

Рис. 1. Фото кальцита на памятнике Сурунгур ( a ), результаты изотопного анализа кислорода в образцах кальцита ( б ): IAEA-603 – международный стандарт, SURCAL – внутренний стандарт.

Особь 1                      Особь 2

Рис. 3. Фотографии исследуемых моляров M1 и M2 Ovicaprine со следами напилов для отбора проб.

Рис. 2. Фотографии исследуемых челюстей Oviсаprine.

не завершено созревание эмали, длина M2 превышает длину M1 всего на 2 мм, следовательно, возраст гибели животного составляет 6–10 месяцев.

Особенности изотопного анализа кислорода в зубной эмали для определения сезона рождения

Исследуемые зубы были зачищены, напил эмали производился последовательно вдоль линии роста зубов с шагом 2–4 мм (рис. 3). Следует подчеркнуть, что представленная методика изотопного анализа кислорода в зубной эмали в корне отличается от методики, которую применяют другие исследователи сезонности рождения: в данной работе анализируется кислород в составе как фосфатных, так и карбонатных групп гидроксиапатита.

В традиционных методиках анализируются карбонаты, составляющие менее 5 % гидроксиапатита по массе. Для получения циклических вариаций δ18O в эмали вдоль линии роста зуба по анализу карбонатов требуется тщательная химическая пробоподготов-ка для удаления органических веществ и экзогенных карбонатов. Для удаления гуминовых кислот, образовавшихся в результате разложения биоорганических соединений в почве, образцы эмали обрабатывают окислителем – 2 масс. % водным раствором гипохлорита натрия (NaOCl) [Balasse et al., 2012, p. 349] или 30%-ным раствором пероксида водорода (H2O2)[Koch et al. 1997, p. 417]. На втором этапе для удаления экзогенных карбонатов в большинстве исследований образцы эмали обрабатывают 0,1 M раствором уксусной кислоты при комнатной температуре в течение 4 ч [Hermes et al., 2019, 20191273; Ventresca Miller et al., 2020, p. 41; Makarewicz et al., 2017, p. 1; Stevens et al., 2011, p. 64; Knockaert et al., 2018, p. 60]. В исследованиях [Tornero et al., 2013, p. 4039] было измерено изменение массы образца после кислотной обработки – масса уменьшается на 30–40 %. Таким образом, данная методика приводит к частичному удалению целевого вещества для изотопного анализа, поскольку pH раствора 0,1 M CH3COOH составляет 2,9, а гидроксиапатиты начинают заметно растворяться уже при pH < 4,5.

В климатических исследованиях требуется многостадийный процесс выделения Ag3PO4 из зубной эмали, поскольку небольшие примеси могут повлиять на абсолютные значения δ18O, необходимые для реконструкции температуры окружающей среды прошлого. Процесс выделения Ag3PO4 до статочно трудоемкий: образцы зубной эмали, предварительно очищенные

Рис. 4. Зависимости δ¹⁸O_VPDB в эмали моляров M1, M2 особей 1 и 2 от расстояния от шейки зуба.

от органических веществ и экзогенных карбонатов, растворяют в 20%-ном растворе HF, затем отделяют жидкую фракцию с помощью центрифугирования, доводят растворы до pH = 5–7, добавляя по каплям 20%-ный раствор аммиака, далее для выделения фосфата серебра к растворам приливают AgNO3, полученный Ag3(PO4)3 несколько раз промывают деионизованной водой, затем высушивают [Tudge, 1960, p. 81].

В рамках нашей работы анализ всего кислорода в составе эмали позволяет получать циклические вариации δ18O без предварительной пробоподготовки (рис. 4). Изотопный анализ кислорода проводится в режиме пиролиза: в присутствии углерода в токе гелия при температуре 1 300 °С происходит переход всего содержащегося в образце кислорода в СО, который анализируется на изотопном масс-спектрометре. Информация об относительном расположении экстремумов δ18O, соответствующих зимним и летним месяцам созревания эмали, достаточна для определения сезонности рождения.

Определение сезона рождения по циклическим вариациям δ18O в эмали моляров M1 и M2 современных Ovicaprine

Для образцов эмали моляров М1 и М2 из нижней челюсти современных домашних Ovicaprine, живших в окрестностях поселка Шак-Шак, наблюдаются циклические зависимости вида «δ18OVPDB – расстояние от шейки зуба» (рис. 4). Направление оси абсцисс на графиках совпадает со временем прорезывания зубов – от кончика к корню. Для моляров M1 и M2 циклические кривые представлены со сдвигом для демонстрации участков зубов, сформировавшихся в один и тот же период времени.

Величины δ18O в зубной эмали исследуемых зубов лежат в диапазоне от –19,5 до –10,5 ‰. Участки эмали с максимальными и минимальными значениями δ18O находятся в середине моляров M1 и ближе к шейкам моляров M2 соответственно. Для определения сезонности рождения Ovicaprine по изотопному составу кислорода в эмали традиционно используют моляр M2, формирующийся в первый год жизни животных. Также возможно использовать моляр M3, однако вследствие широкого диапазона времени прорезывания данного зуба точность определения сезона рождения мелкого рогатого скота низкая. У Ovis aries моляр M2 начинает закладываться на втором месяце жизни, однако процесс созревания эмали длится ок. 4 месяцев [Zazzo et al. 2010], поэтому для определения сезона рождения по циклическим вариациям δ18O вдоль линии роста M2 необходимо учитывать суммарный сдвиг ок. 5 месяцев [Balasse et al., 2012, p. 349]. Значения δ18O в эмали на кончиках моляров M2 близки к максимумам и соответствуют концу лета (август), а если учесть сдвиг 5 месяцев, то получаем сезон рождения исследуемых животных – ранняя весна (март – апрель). По свидетельствам местных жителей типичное время окота овец в поселке Шак-Шак приходится на начало весны.

Определение сезонности рождения по вариациям δ18O вдоль линии роста моляра M1 в литературе не найдено. Рассмотрим стадии формирования моляра М1: закладка моляра происходит в пренатальный период в среднем на 56 день беременности овцы, беременность длится примерно 150 дней [Witzel et al., 2018]. Следовательно, моляр M1 формируется три месяца до рождения особи, а прорезывание М1 полностью завершается к 6 месяцам жизни животного [Silver, 1963, p. 283]. Если созревание эмали M1 длится 4 месяца, то величина δ18O на кончике моляра M1 должна с точностью до месяца показывать время рождения особи. Для обеих исследуемых особей значения δ18O на кончике M1 и расположение относительно максимума указывает на рождение животных в марте – апреле.

Заключение

Для определения сезонности рождения Ovicaprine предложен метод изотопного анализа кислорода в зубной эмали с использованием современной методики, основанной на восстановлении компонентов эмали углеродом до CO непосредственно в элементном анализаторе, который используется в тандеме с изотопным масс-спектрометром. Преимуществом данной методики изотопного анализа по сравнению с традиционным анализом карбонатов является: 1) отсутствие длительной и трудоемкой химической пробоподготовки; 2) изотопный анализ всего кислорода в эмали, 90 % которой со стоит из фосфатов, устойчивых к процессам диагенеза. Впервые предложено использование моляров М 1 для определения сезонности рождения мелкого рогатого скота. Для решения исследовательских задач, направленных на выявление сезонности рождения без необходимости проведения палеоэкологических реконструкций, достаточно информации о расположении минимумов и максимумов ẟ18O вдоль линии роста зуба.

Работа проведена при поддержке проекта РНФ № 2328-01126 «Изотопный анализ зубной эмали для реконструкции сезонности рождения мелкого рогатого скота в период раннего одомашнивания на основе материалов поселения Джейтун (Северный Копетдаг)». Коллектив авторов выражает благодарность PhD Уильяму Рендю (Национальный центр научных исследований Франции (CNRS)) и канд. ист. наук Чаргынову Темирлану Таш-танбековичу (Кыргызский национальный университет им. Ж. Баласагына) за определение возраста гибели исследуемых Ovicaprine.