Апробация системы высокочувствительной детекции патогенных микроорганизмов в аквакультуре обыкновенного карпа Cyprinus carpio Linnaeus, 1758

По данным ФАО рыба и рыбопродукты являются одним из главных источников белка для человека, на их долю приходится более 80% общего объема потребляемых морских продуктов. Поскольку вылов рыбы традиционной рыбной ловлей остается постоянным (статистика ФАО по рыбоводству), существующая нехватка в рыбе и рыбопродуктах должна быть восполнена за счет рыбоводства [1]. В настоящее время технология разведения гидробионтов в мари- и аквакультуре превратилась в динамично развивающийся сектор на международном рынке, обеспечивающий около 25% всего мирового потребления рыбы. При этом Российская Федерация по наличию водоемов, отвечающих требованиям культивирования гидробионтов, занимает первое место в мире [2]. Факторами, сдерживающими успешное развитие пресноводного рыбоводства, являются заболевания рыб различной этиологии.

Наиболее широко распространённым и наносящим значительный ущерб предприятиям аквакультуры бактериальным заболеванием является бактериальная геморрагическая септицемия (БГС, аэромоноз) – полиэтиологическое заболевание

рыб [3]. Традиционно работы по эпизоотической оценке рыбоводных предприятий выполняются с проведением бактериологических исследований выращиваемых рыб, кормов и воды. Посевы проводятся непосредственно из биологического материала на селективные питательные среды, культивирование отдельных групп микроорганизмов занимает от 5 до 10 сут. Длительность процедуры постановки диагноза и возможные ошибки, связанные с несвоевременностью получения результатов, нередко приводят к неправильному выбору лекарственных средств и как следствие – к ухудшению эпизоотической ситуации. В связи с этим актуальной является разработка современных чувствительных экспресс-методов детекции патогенных агентов в конкретных водных объектах. Множество исследований посвящены оценке возможности использования молекулярно-генетических методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детекции и идентификации возбудителей инфекций [4-6]. Прямой анализ маркерных фрагментов геномов позволяет избегать проблем культивирования и неспецифической детекции, а также эффективно и быстро выявлять целевые группы микроорганизмов в пробах биологического материала. Диагностика бактериальных инфекций на основе видо-специфичной амплификации активно развивается и применяется в странах с развитой мари- и аквакультурой (Норвегия, Канада и др.) [7-11].

Рыбное хозяйство занимает существенное значение в экономической инфраструктуре Байкальского региона. В Иркутской области работают Бурдугузский рыбоводный завод на Иркутском водохранилище (ввод в эксплуатацию в 1968 г.) и Бельский – на р. Белой (ввод в 1964 г.). По данным ФГБУ «Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория» ранее отмечались случаи возникновения заболеваний молоди карпа в бассейнах Бурдугузского рыбзавода, вызванные Aer-omonas hydrophila (экспертиза № 137 от 24.01. 2003 г.). С 2004 г. предприятие не функционировало и было вновь запущено в 2011 г. в рамках программы «Развитие рыбохозяйственного комплекса региона на 2012-2016 годы». Одна из целей проекта – создание условий для рыборазведения и производства рыбной продукции. Для успешного её достижения необходим мониторинг инфекционных заболеваний объектов культивирования с использованием современных методов детекции патогенных агентов.

Цель работы: разработка методов высокочувствительной детекции патогенных микроорганизмов родов Aeromonas и Flavo-bacterium на внешних покровах карпа Cyprinus carpio .

Материалы и методы . В сентябре 2011 г. на Бурдугузском рыбоводном заводе началась эпизоотия язвенной болезни среди маточного стада карпа. На исследование был взят один экземпляр карпа с множественными обширными язвенными поражениями на внешних покровах тела (рис. 1).

Рис. 1. Обширные поражения внешних покровов карпа: общий вид (А), возле грудных плавников и на жаберных крышках (Б), дорсальная поверхность тела возле спинного плавника (В)

Длина тела (до конца чешуйного покрова) самки карпа составила 540 мм, масса 2870 г. Непосредственно после отлова в лабораторных условиях были взяты соскобы и образцы тканей с пораженных участков тела, выделена суммарная ДНК с использованием коммерческого набора ДНК-сорб В (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) по протоколу фирмы-производителя. Фрагменты гена 16S рРНК амплифицировали как с разработанными в данном исследовании, так и с опубликованными ранее [12] праймерами, специфичными для представителей родов Aeromonas (АF1 5’-gataagtta gatgtgaaagcccc и AHyd2 5’-ggggctttcacatctaacttatc)

и Flavobacterium (Ff1 5’-tctaccttttacagagggatagc и Fr1 5’-gacgacaaccatgcagcacc). Реакцию амплификации проводили в режиме: 96^оС 10’’; 66^оС 20’’; 72^оС 60’’ 35 циклов. Полученные ампликоны, длиной 544 и 925 п.н., соответственно, лигировали в вектор GeneJET^TM (GeneJET^TM PCR Cloning Kit, Fermentas, Литва). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) в Новосибирском приборном центре коллективного пользования СО РАН.

Результаты и обсуждение. Результаты ПЦР анализа суммарной ДНК, выделенной из поражений внешних покровов разной степени тяжести, продемонстрировали присутствие в них представителей родов Aeromonas и Flavo-bacte-rium (рис. 2). Секвенирование полученных фрагментов гена 16S рРНК позволило идентифицировать микроорганизмы Flavobacterium psy-chrophilum и Aeromonas sp.

Рис. 2. Результаты амплификации фрагментов гена 16S рРНК суммарной ДНК из язвенных поражений карпа на праймерах, специфичных для Aeromonas (1) и Flavobacterium (2). 3 – маркер молекулярного веса

1500 п.н.1000 п.н.500 п.н.

Использованная в работе система праймеров специфична для одного из наиболее широко распространенных семейств группы Bactero-idetes/Chlorobi класса Flavobacteriia – Flavobacter-iaceae и позволяет амплифицировать до 100% известных представителей рода Flavobacterium , среди которых известен целый спектр патогенных для рыб микроорганизмов ( Flavobacterium psychrophilum, F. columnare, F. branchiophilum ). Обнаруженный в проведенном молекулярногенетическом анализе F. psychrophilum (син.: Cy-tophaga psychrophila , Flexibacter psychrophilus ) первоначально определен как типичный патоген, вызывающий язвы на теле и гниль плавников лососевых рыб при низких температурах

(бактериальная холодноводная болезнь, англ. «visceral myxobacteriosis» и/или «bacterial cold water disease» (BCWD), «coldwater disease» (CWD) [13]). F . psychrophilum выделяет протеолитические ферменты, которые вызывают прямое повреждение тканей и расширение зоны поражения, что является одним из предлагаемых факторов вирулентности бактерии [14, 15]. Инфицированные рыбы, как правило, имеют повреждения внешних покровов тела, приводящие к обнажению мышц и позвоночника [16]. Наиболее восприимчивы к заболеванию искусственно воспроизводимые виды рыб семейств Salmoni-dae, Coregonidae, Cyprinidae и Percidae [17].

Вторая апробированная система праймеров позволяет выявлять представителей рода Aero-monas – одного из типичных для водной микробиоты. Определенные в результате проведенной работы нуклеотидные последовательности идентичны Aeromonas sp. (GenBank: HQ246247), полученной при исследовании микробного сообщества аквакультуры тиляпии [18] и отличаются одной заменой от A. sobria, A. hydrophila , A. cavi-ae и A. jandaei . Необходимо отметить, что последовательность анализированного фрагмента крайне консервативна для рода Aeromonas и идентична для патогенных видов.

Заболевания рыб, вызванные представителями рода Aeromonas в аквакультуре, характеризуются высокой летальностью. Наиболее полно изучен «фурункулез» – системная болезнь лососевых рыб, вызываемая Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida [19]. Другие подвиды A. salm-onicida также вызывают системные и язвенные болезни рыб. Мезофильные аэромонады ( A. hy-drophila , A. caviae и A. sobria ), чаще всего поражают прудовых рыб [19].

Смешанные инфекции у рыб возникают при одновременном сочетанном воздействии нескольких возбудителей. Кожа является наиболее восприимчивым органом-мишенью для инфекционных агентов рыб [20]. Инфицирование бактериями, грибами и вирусами способствует возникновению инфекционного язвенного синдрома кожи, которое характеризуется появлением красных пятен и язв на внешних покровах и сопровождается высокой смертностью различных видов рыб [21, 22 и др.]. Целостность кожи играет важную роль в защите рыб от бактериальных инфекций за счет присутствующих в слизи антимикробных продуктов (лизоцим, агглютинины) [23]. Отмечено значительное увеличение численности бактерий в местах отслоения эпителиальных клеток. Только редкие бактериальные клетки были обнаружены на неповрежденной коже или вблизи зон поражений [24]. Гистологические исследования распределения F. psychrophilum на коже рыб выявили его присутствие только на микротравмах, причем интактные участки кожи остаются неинфицированными. Бактерии имеют сродство к коллагену, благодаря чему при попадании в дерму мигрируют в миосепты через соединительную ткань. Впоследствии зоны поражений захватывают основную мускулатуру, что приводит к развитию некротического миозита и формированию открытых язв [25]. Аэромонады же преимущественно поражают ранее поврежденные ткани, как правило, зоны эрозии [24].

Эпизоотия на Бурдугузском рыбоводном заводе началась после перевода маточного стада карпа из рыбохозяйственных прудов в бассейны с проточной водой. Так как регулярно проводимые в условиях аквакультуры манипуляции с рыбами во время отлова и транспортировки часто приводят к травмированию их внешних покровов, это в совокупности с присутствием патогенов в окружающей среде приводит к возникновению заболеваний.

Поскольку разработанная диагностическая система позволяет детектировать присутствие представителей родов Aeromonas и Flavobacterium в любых образцах (как в соскобах внешних покровов, так и в пробах воды), ее применение целесообразно на всех основных этапах технологического процесса для мониторинга микробиоты в аквакультуре рыб и своевременной коррекции графика проведения санитарно-эпизоотических мероприятий.

Работа выполнена при поддержке ГК № 16.512.11.2075 Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» проект № 30.13.