Археогенетический анализ индивида из захоронения с территории древнего Ярославского кремля

Монголо-татарское нашествие на Русь армии Бату-хана, начавшееся осенью 1237–1238 гг., и последовавшее за ним иго Золотой Орды, продолжавшееся почти два с половиной столетия, не только сыграли огромную роль в истории Древней Руси, но и, очевидно, внесли значительный вклад в формирование генофонда населения нашей страны. В результате похода армии Бату-хана на Северо-Восточную Русь были разгромлены Рязанская и Владимиро-Суздальская земли. В декабре 1237 г. Рязань была захвачена и полностью разрушена, а в начале февраля 1238 г. войска Бату-хана осадили и взяли столицу Владимиро-Суздальского княжества – город Владимир. Далее монгольское войско разделилось на несколько отрядов, часть из них двинулась на северо-запад, другая часть разорила территорию междуречья Клязьмы и Волги. У городов, встречавшихся на пути армии Бату-хана, было лишь два варианта – сдаться или погибнуть ( Кривошеев , 2015). Ни в одном летописном источнике не упоминаются подробности взятия армией Бату-хана Ярославля, что дало повод некоторым историкам предположить, что Ярославль, как и ряд других древнерусских городов, был сдан без боя.

Раскопки, проведенные в 2004–2013 гг. экспедицией ИА РАН, выявили свидетельства жестокого разорения города в 1238 г. ( Энговатова и др ., 2009; 2013). В результате исследований на ярославском детинце – Рубленом городе, были обнаружены массовые захоронения нескольких сотен индивидов ( Энговатова и др. , 2013; Энговатова , 2019а; 2019б; Тарасова , 2019). По заключению антропологов, причинами смерти многих обнаруженных в них людей стали колотые и рубленые ранения, нанесенные холодным оружием, переломы от различных видов контактного и дистанционного оружия и их последствия ( Гончарова, Бу-жилова , 2007). Антропологические данные свидетельствуют о насильственной и жестокой гибели изученной группы населения Ярославля, скорее всего, при нападении на город военного отряда. Судя по некоторым ранам, удары наносили всадники ( Buzhilova, Goncharova , 2009; Энговатова и др. , 2009; 2010).

Краниологическое исследование серии и реконструкция возможной этнической принадлежности в ней впервые были проведены на материалах одного из самых больших по количеству погребенных массового захоронения (Гончарова, Бужилова, 2007). Несмотря на небольшой размер выборки, специалисты-антропологи определили местное славянское происхождение погребенных, сохранивших в слабой форме финно-угорские черты, что характерно для потомков кривичей в целом (Происхождение и этническая история…, 1965; Алексеева, 1973; Веселовская и др., 2015). Также на основе одонтологического анализа были выявлены некоторые черты северного грацильного одонтотипа, связанного с финноязычным населением (Харламова, 2014). Анализ остеометрических данных показал сходство ярославских мужчин с мужским населением не только других древнерусских городов различных регионов, но и территории Волжской Булгарии домонгольского времени (Тарасова, 2019. С. 157, 158; Тарасова и др., 2019). По предварительным заключениям, краниологические параметры черепов из ярославских захоронений соответствуют представлениям о вятиче-ском населении региона. Однако в целом разнообразие краниологических типов ярославцев оказалось весьма велико (Гончарова, 2011). В связи с этим важно отметить исторический контекст находок – поскольку в составе коллективных захоронений могли оказаться останки не только жителей самого детинца, но и населения, жившего вне города и укрывшегося в момент опасности за стенами, а также даже возможно воинов из нападавшего войска Бату-хана.

В то же время на основании расширенных краниологических исследований был сделан вывод о генетической неоднородности погребенных, погребенных, антропологический тип которых определялся этническим происхождением, особенно мужчин, что может быть обусловлено спецификой формирования населения детинцев древнерусских городов на основе военной аристократии и дружины (Там же), или довольно разнообразный антропологический состав погребенных мог быть обусловлен спецификой формирования этих погребений.

Внимание исследователей привлек индивид № 2 из массового захоронения № 76, обнаруженного при раскопках Рубленого города и содержащего останки 41 человека ( Энгова това и др ., 2012б).

Уникальной находкой оказались остатки высоких кожаных сапог в районе голеней и стоп индивида № 2. Реконструкция показала, что сапоги имеют форму и отличительные особенности, нехарактерные для обуви жителей Древней Руси. Анализ аналогий кроя сапог показал, что подобная обувь была распространена среди кочевников, в частности, половцев ( Энговатова и др. , 2012б. С. 203, 204).

В результате антропологического изучения этих останков были описаны особенности его физического строения, патологии костной системы. Индивидуальная реконструкция его портретных черт позволила говорить о его непохожести на большинство ярославцев ( Энговатова и др ., 2012а. С. 252). На основании полученных данных были сделаны выводы о том, что данный индивид много ездил верхом и регулярно переносил значительные физические нагрузки. Выдвигались предположения о принадлежности этого человека к воинской элите или ремесленникам ( Энговатова и др. , 2012б; 2015). С оговоркой, что характеристика краниологических вариантов на индивидуальном уровне не соответствует методическим основам антропологического исследования, было отмечено, что череп данного индивида обладает чертами, типичными для черепов зливкин-ского типа (европеоидного с ослабленной горизонтальной профилировкой). Подобные краниотипы часто встречались в среде населения Волжской Булгарии ( Ефимова , 1991. С. 21).

В данной работе мы применили методы геномного анализа для определения вероятного происхождения индивида № 2 из массового захоронения № 76 на территории древнего Ярославля.

Материалы и методы

Выделение ДНК, приготовление геномных библиотек и секвенирование

Для выделения ДНК использовали фрагменты бедренной кости (рис. 1) и зуба индивида № 2 из массового захоронений № 76 на территории Рубленого города. Радиоуглеродное датирование (AMS) материалов из массовых захоронений

Рис. 1. Фрагмент бедренной кости индивида № 2, использованный для генетического анализа с использованием Байесовской хронологической модели определило узкий интервал дат от 1197 до 1280 н.э. с медианным значением 1239 г. н. э. (Engovatova, Cherkinsky, Zaiseva, 2020. P. 1833).

Все работы с древними образцами проводили в специально оборудованных для изучения древней ДНК помещениях. 100–150 мг костного фрагмента после механической очистки от загрязнений измельчали в шаровой мельнице MM200 (Reitch), после чего полученный костный порошок лизировали в присутствии 0,5 M EGTA, 20 мг/мл протеиназы К и 1 M DTT при температуре 56 °С в течение 2–3 ч. После осаждения центрифугированием осадка в полученном лизате супернатант смешивали с 10 объемами буфера PNI (Qiagene) и проводили дальнейшую очистку ДНК на колонках DNA MinElute Column (QIAGEN). Негативный контроль выделения ДНК был использован при каждой экстракции. Из выделенной ДНК были приготовлены фрагментные геномные библиотеки с двойными индексами по протоколу, основанному на использовании одноцепочечной ДНК ( Gansauge et al. , 2017). Перед приготовлением библиотек проводили репарацию тотальной ДНК смесью ферментов PreCR MIX (NEB). Готовые библиотеки были просеквенированы на платформе Illumina HiSeq 2000/2500 в режиме парноконцевых или одиночных прочтений.

Картирование коротких прочтений и первичный анализ данных секвенирования

Для удаления адаптерных последовательностей из коротких прочтений, полученных в результате полногеномного секвенирования, мы использовали программу AdapterRemoval v2.3.1 (Schubert et al., 2016), а фрагменты длиной более 25 п. н. использовали для дальнейшего анализа. Фрагменты были картированы на референсный геном человека (сборка hg37), а также на референсный митохондриальный геном человека – rCRS, NC_012920.1 (Andrews et al., 1999) – с помощью программы BWA v0.7.17 (Li, Durbin, 2009) c параметрами, рекомендованными для анализа древней ДНК (Schubert et al., 2012). Дупликаты прочтений маркированы с помощью MarkDuplicates из пакета программ Picard toolkit v2.22.2 (http://broadinstitute.github.io/picard/).

Определение пола

Для определения пола с помощью функции idxstats из пакета программ Samtools (Li, Durbin , 2009) рассчитывали число прочтений, картированных с высоким качеством (MQ > 25) на каждую из аутосом и половые хромосомы. Затем полученное для каждой хромосомы число прочтений делили на ее длину и проводили определение пола индивида по соотношению прочтений, картированных на X- и Y-хромосомы, и прочтений, картированных на аутосомы.

Оценка контаминации современной ДНК

Для оценки уровня контаминации полученных образцов фрагментами современной ДНК мы использовали два подхода. Во-первых, для оценки аутентичности полученной ДНК, а также для изменения параметров качества нуклеотидов (снижение параметра base quality для нуклеотидов, потенциально содержащих мутации, характерные для древней ДНК) применяли пакет mapDamage v2.0.8 ( Jónsson et al. , 2013). Кроме того, уровень контаминации мтДНК определяли с использованием программы Schmutzi ( Renaud et al. , 2015).

Определение гаплогруппы митохондриальной ДНК

Поиск вариантов в последовательностях геномной и митохондриальной ДНК проводили с использованием программы FreeBayes v1.2.0 ( Garrison, Marth , 2012). Полученные VCF-файлы были отфильтрованы с использованием программы Bcftools с применением следующих параметров: QUAL > 35, FORMAT/DP ≥ 3. Гаплогруппу мтДНК определяли с помощью Haplogrep v2.1.20 ( Kloss-Brandstätter et al. , 2011; Weissensteiner et al. , 2016). Дополнительно участки поли-С-тракта (позиция 310 по rCRS) и CA-повтора (позиции 521–524 по rCRS) проверяли визуально в программе IGV ( Robinson et al. , 2011).

Филогенетический и филогеографический анализ

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов проводили с помощью метода медианных сетей (Bandelt et al., 1995), реализованного в пакете программ mtPhyl v2.8 (http://eltsov.org). При построении филогенетических деревьев полиморфизм длины в участках мтДНК 16180–16193, 309–315, 522–524, 573–576, а также нуклеотидные замены в позиции 16519 не учитывали. Поскольку в пакете программ mtPhyl v2.8 в качестве референсной используется ранняя версия классификации мтДНК человека, предложенная разработчиками онлайн-ресурса PhyloTree (van Oven, Kayser, 2009; www.phylotree.org), все полученные филогенетические деревья проверяли и дополняли вручную c учетом всех модификаций номенклатуры гаплогрупп, представленной в 17-й версии PhyloTree (18 Feb. 2016).

Для проведения филогеографического анализа использовали нуклеотидные последовательности целых митогеномов, представленные в базах данных современных (GenBank…; www.ncbi.nlm.nih.gov ; Logan DNA Project…; http:// www.ianlogan.co.uk ) и древних (AmtDB…; https://amtdb.org ) образцов. По состоянию на начало 2020 г. в GenBank содержится более 52 000 митохондриальных геномов от представителей различных этнических групп мира (MITOMAP…; www.mitomap.org ), а в AmtDB v.1.005 представлена информация о 1801 древнем митогеноме.

Тотальная геномная ДНК была выделена из образцов костных фрагментов бедренной кости (три независимых выделения ДНК) и зуба индивида № 2 из коллективного захоронения № 76 с территории Ярославского кремля и использована для приготовления фрагментных геномных библиотек. Четыре независимые библиотеки, приготовленные из ДНК, выделенной из фрагмента бедренной кости, и одна библиотека из ДНК, выделенной из зуба, были просеквенированы на приборе Illumina HiSeq 2000/2500 в режиме парноконцевых и одиночных чтений с длиной прочтения 50–75 п. н. Суммарно было получено более полумиллиона коротких прочтений; 32 % прочтений со средней длиной 51 п. н., оставшихся после удаления адаптерных последовательностей, было картировано на референсный геном человека hg37 и на последовательность rCRS (табл. 1). Для снижения уровня постмортальных мутаций тотальная геномная ДНК перед приготовлением геномных библиотек была репарирована с использованием смеси ферментов PreCR MIX (NEB), тем не менее на концах фрагментов ДНК сохраняется повышенный уровень специфических для древней ДНК замен (рис. 2), что подтверждает принадлежность исследованных образцов к древней ДНК.

Таблица 1. Сводная информация о результатах секвенирования ДНК индивида № 2 и картирования полученных прочтений на геном

Образец	Количество прочтений	Количество прочтений после удаления адаптеров	Средняя длина фрагментов ДНК	Картировано на геном человека (hg37)	Среднее покрытие полного генома	Среднее покрытие митохондриального генома
Индивид № 2	5,4 × 108	443716924	51,63471	32 %	0,981293	62,92516

Рис. 2. Профиль нуклеотидных замен в библиотеке, приготовленной из ДНК индивида № 2, соответствует профилю, характерному для постмортальных замен в древней ДНК, наблюдается специфическое повышение уровня замен C > T (красный) к концам фрагментов

I

I1a1

I

9053 I I1a1a аХ153234_финн

КР146236_поляк

КТ193619_финн

I

I--------+1

11939             3290481

62164033A

Индивид № 2        9139'

KT997962.1 поляк, украинец MK732936.1 финн

Рис. 3. Фрагмент филогенетического дерева митохондриальных геномов гаплогруппы I1a1a. Образец мтДНК индивида № 2 выделен желтым цветом. Мутации указаны на ветвях относительно rCRS ( Andrews et al. , 1999), для транзиций показан только номер нуклеотидной позиции, для трансверсии приводится тип замены, подчеркнута нуклеотидная позиция обратной мутации. Для образцов из баз данных указан номер в GenBank и этническая принадлежность

Отношение среднего покрытия X- и Y-хромосом к среднему покрытию аутосом (0,55 и 0,5 соответственно) свидетельствует о принадлежности костных фрагментов индивида № 2 мужчине.

Был показан низкий уровень контаминации образца по мтДНК (не более 1 %), что позволило на основе полученных данных реконструировать полную последовательность митохондриального генома со средним покрытием × 62,9 и определить принадлежность индивида № 2 к митохондриальной гаплогруппе I1a1a.

Проведенный нами филогенетический и филогеографический анализ показал, что гаплогруппа, к которой относится митогеном индивида № 2, встречается у современных представителей Европы (рис. 3, табл. 2), а также у древнего населения Польши (I–II тыс. до н. э.) и Венгрии (X–XI вв.). Среди носителей гаплогруппы I1a1a нет ни одного индивида, проживавшего в азиатской части Евразии.

Таблица 2. Выявленные в открытых базах данных последовательности митохондриальной ДНК, принадлежащие гаплогруппе I1a1a

№	GeneBank ID	Этническая принадлежность/происхождение
1	MG646266	Польша / современность
2	MG952793	Венгрия / современность
3	KY671032	Россия, Тула / современность
4	MG646256	Польша / современность
5	MF487841	Германия / современность
6	MK202791	Россия / современность
7	KY671065	Россия, Владимир / современность
8	KY671085	Россия, Владимир / современность
9	MH120665	Польша / современность
10	MK103008	Швеция / современность
11	KT336633	Россия, Воронеж / современность
12	KY409854	Италия, Сардиния / современность
13	KY410140	Италия, Сардиния / современность
14	KF146237	Италия, Сардиния / современность
15	JQ245767	Турция / современность
16	KP150427	США / современность
17	KP974689	США / современность
18	KF162661	Дания / современность
19	MH120465	Польша / современность
20	JQ702939	Финляндия / современность
21	JQ705140	нет данных / современность
22	KC170986	Украина / современность
23	KY399192	Италия, Сардиния / современность
24	KY496888	Финляндия / современность

Окончание табл. 2

№	GeneBank ID	Этническая принадлежность/происхождение
25	AY339505	Финляндия / современность
26	AY339502	Финляндия / современность
27	KC763444	Финляндия / современность
28	KC763443	Финляндия / современность
29	JQ703652	нет данных / современность
30	U0057	Россия, Татарстан /современность
31	MHper_28	Венгрия, X–XI вв. н. э.
32	MN699895	Польша, 1450–1300 гг. до н. э.
33	MN699896	Польша, 1492–1297 гг. до н. э.
34	MN699882	Польша, 2029–1779 гг. до н. э.
35	MN699884	Польша, 2120–1885 гг. до н. э.

Обсуждение результатов

Раскопки на территории Ярославля, проведенные в 2004–2013 гг. экспедицией ИА РАН, выявили археологические свидетельства жестокого разорения города войсками Бату-хана в 1238 г. ( Энговатова и др. , 2009; 2013). Ранее антропологические исследования показали, что причиной смерти большинства обнаруженных в массовых захоронениях индивидов явились колотые и рубленые ранения, дырчатые переломы от различных видов контактного и дистанционного оружия и их последствия ( Гончарова, Бужилова , 2007. С. 60–62), что позволило сделать вывод о насильственной и жестокой смерти изученной группы населения Ярославля, которое подверглось нападению профессионального военизированного отряда всадников ( Buzhilova, Goncharova , 2009; Энговатова и др. , 2009; 2010). По предварительным заключениям антропологов, краниологические параметры черепов из ярославских захоронений соответствуют представлениям о вятичском населении региона ( Энговатова и др. , 2009). Однако в целом разнообразие краниологических типов ярославцев оказалось весьма велико ( Гончарова , 2011). Уникальная находка остатков высоких кожаных сапог, нехарактерных для древнего населения Ярославля, принадлежащих одному из мужчин, погребенных в массовом захоронении в сооружении № 76, а также индивидуальное описание его портретных черт позволили говорить о его непохожести на большинство ярославцев ( Энговатова и др. , 2012а. С. 252). Анализ аналогий кроя сапог показал, что подобная обувь была характерна для кочевников и, в частности, распространена среди половцев ( Энговатова и др. , 2012б. С. 203, 204). В результате антропологического изучения останков этого индивида были описаны особенности его физического строения, патологии костной системы, а также отмечено сходство черт его черепа с черепами злив-кинского типа (Там же), который был распространен у населения Волжской Булгарии.

Мы выделили ДНК из костных фрагментов бедренной кости и зуба данного индивида и использовали ее для геномного секвенирования. На основе полученных данных реконструирована полная последовательность мтДНК индивида № 2 и показана ее принадлежность к митохондриальной гаплогруп-пе I1a1a. Проведенный нами филогеографический анализ показал, что эта гаплогруппа распространена на территории современной Восточной Европы в популяциях русских, украинцев, поляков, а также встречается у финнов и итальянцев. Представители древнего населения – носители данной гапло-группы – также проживали на европейской территории (табл. 2). Следует отметить, что индивид № 2 имеет общий вариант в позиции 3513 с современным украинцем и финном. Таким образом, полученные нами данные однозначно свидетельствуют о европейском, но не азиатском происхождении индивида № 2 по материнской линии.

Подобные результаты являются еще одним подтверждением того, что особенности портретных черт, физического типа, профессиональной специализации и необычных деталей костюма человека могут быть только косвенными свидетельствами его происхождения, судить о котором, даже при применении геномного метода, можно только лишь в масштабе генетического разнообразия уже исследованных популяций.

Заключение

Проведенное археогенетическое исследование мтДНК позволило вернуться к проблеме происхождения индивида № 2, имеющего значительные отличия во внешности от большинства людей из санитарных захоронений погибших жителей средневекового Ярославля. Определение происхождения индивида на основании молекулярно-генетических методов – новый подход для современной археологии. Палеоантропологические методы позволяют характеризовать изменчивость групп и делать заключение об их происхождении. Полученные данные указывают на западноевразийское происхождение предков индивида № 2 по женской линии. Это еще один шаг в понимании сложного состава населения Ярославля и военизированного отряда, уничтожившего город. На настоящем уровне исследования можно с уверенностью судить об отсутствии восточноазиатских корней по материнской линии у индивида № 2, что делает менее вероятным его принадлежность к элите войска Бату-хана. Будущее изучение ядерной ДНК позволит более полно оценить генетические корни индивида.