Антагонистическая активность амилолитических штаммов бактерии Bacillus subtilis

Введение. Термин «пробиотики» был предложен в 1977 году Л. Ричард и Р. Паркер для обозначения живых микроорганизмов и продуктов их ферментации, обладающих антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам и обеспечивающих равновесие кишечной микрофлоры.

Для отбора штаммов микроорганизмов в качестве пробиотиков предложено несколько критериев - это апатогенность, специфическое окрашивание по Граму, резистентность к желчи, органическим кислотам и окислителям, устойчивость к ряду антибиотиков, колонизация и (или) адгезия к клеткам слизистой оболочки пищеварительного тракта, а также наличие антагонистических свойств по отношению к энтеро- патогенным микроорганизмам. Важна также технологичность, т. е. способность к быстрому накоплению биомассы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении [4].

Препараты-пробиотики, изготавливают из живых антагонистически активных бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и животных - кишечной палочки (колибактерин), бифидобактерий (бифидумбактерин, бифидумбактерин форте, бифилиз), смеси кишечной палочки и бифидобактерий (бификол), лактобактерий (лакто-бактерин, ацилакт, аципол). В последние годы для лечения дисбактериозов в лечебную практику были внедрены отечественные препараты, изготовленные на основе живых апатогенных антагонистически активных представителей рода Bacillus : споробактерин, бактиспорин, био-спорин [3].

В медицине на основе различных штаммов Bac. subtilis , изолированных из почвы, выпускают ряд лечебных препаратов («Споробакте-рин», «Биоспорин», «Бактиспорин»), которые применяются для лечения желудочно-кишечных расстройств [6]. Кроме перечисленных выше лекарств -пробиотиков, штаммы Bacillus subtilis входят в состав пищевых добавок, таких как «Бактистатин», «Супрадин», «Ветом» и другие. Для ветеринарии и сельского хозяйства также используются штаммы Bac. subtilis в ряде лекарств и продуктов. В частности, пробиотик «Субтилис» (жидкая форма «Субтилис-Ж» и порошок «Субтилис-С»), включающий в свой состав микробную массу живых бактерий, применяется в животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве для профилактики и лечения заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, дисбактериоза, легочных инфекций, увеличения продуктивности, получения здорового потомства, подавления роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов (сальмонеллы, кишеч ной палочки, аэромонад, псевдомонад, протея, синегнойной палочки и других) [2, 5].

Антагонизм пробиотиков основан на преобладании их в конкурентной борьбе с условнопатогенными микроорганизмами за среду обитания, в частности за питательные вещества в пищеварительном тракте. На этом основан лечебно-профилактический эффект пробиотиков.

Заболевания желудочно-кишечного тракта у молодняка животных могут вызываться не только кишечной палочкой, но и несколькими видами микроорганизмов одновременно. В этом случае говорят об ассоциированных инфекциях. В ассоциации могут входить в различных сочетаниях такие энтеропатогенные микроорганизмы, как кишечная палочка ( Escherichia сoli ), сальмонелла ( Salmonella dublin ), протей ( Proteus vulgaris ), синегнойная палочка ( Pseudomonas aeruginosa ), стрептококк ( Streptococcus pneumonia ) и другие.

В животноводстве применение пробиотиков имеет большое значение для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у молодняка крупного рогатого скота. Заболевание колибактериозом может возникать у телят в течение первого месяца после рождения. Телята, начиная с 10–14-дневного возраста, постепенно переходят от молочного типа кормления к поеданию растительного корма, в частности сена. С переходом на питание растительным кормом желудочно-кишечный тракт телят постепенно заселяется бактериями вида Bacillus subtilis (сенная палочка), которая становится постоянным обитателем рубца. Основная роль этой бактерии – это расщепление крахмала до простых сахаров за счет выделения ею амилолитического фермента. В научной литературе обсуждается роль Bac. subtilis как антагониста по отношению к энтеропатогенным микроорганизмам и целесообразность скармливания телятам пробиотика, созданного на основе этой бактерии [4]. Его применение способствует нормализации микробиального состава желудочно-кишечного тракта, что является наиболее физиологически адекватным методом профилактики у телят желудочно-кишечных заболеваний.

Цель исследования: изучение антагонистической активности амилолитических штаммов Bacillus subtilis по отношению к некоторым видам энтеропатогенных бактерий. В связи с этим мы ставили перед собой на разрешение следующую задачу: изучить рост колоний амилолитических штаммов Bacillus subtilis на плотных питательных средах, содержащих различные виды энтеропатогенных микроорганизмов.

Объект и методика исследования . Изучение антагонистической активности амилолитических штаммов бактерии Bacillus subtilis по отношению к энтеропатогенным бактериям проводили в условиях лаборатории ветеринарной медицины Красноярского НИИЖа и в Научно-исследовательском испытательном центре Красноярского ГАУ. В качестве испытуемых микроорганизмов использовали три штамма бактерии Bacillus subtilis – это шт. № 2-amylolitic, № 9-amylolitic и № 12-amylolitic. Микроорганизмы были выделены из предоставленного нами материала в ФГУП ГосНИИ Генетика (Москва) и приняты на национальное патентное депонирование во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Там же было установлено, что штаммы продуцировали амилолитический фермент.

В качестве тестовых использовали следующие музейные культуры энтеропатогенных микроорганизмов – это Escherichia coli , Salmonella dublin , Proteus vulgaris , Pseudomonas aeruginosa и Streptococcus pneumoniae .

В качестве плотной питательной среды использовали среду Сабуро. Культивирование микроорганизмов производили в термостате при t = 38 °С.

Антагонистическую активность оценивали на плотных питательных средах по диаметрам зон лизиса вокруг колоний амилолитических штаммов.

Подготовку к опытам проводили следующим образом. Расплавленную питательную среду Сабуро наливали в чашку Петри и на стадии ее застывания в стерильных условиях добавляли в нее суточную культуру одного из видов энтеро-патогенных бактерий. Покачиванием чашки Петри равномерно распределяли микроорганизмы по всей среде, а после застывания среды в нее методом лунок делали посев культуры одного из амилолитических штаммов Bacillus subtilis .

Схема опытов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема опытов на плотной питательной среде Сабуро

Штамм в питательной среде	Амилолитические штаммы Bacillus subtilis , добавляемые в чашку Петри
E. coli	шт. № 2-amylolitic	шт. № 9-amylolitic	шт. № 12-amylolitic
S. dublin	шт. № 2-amylolitic	шт. № 9-amylolitic	шт. № 12-amylolitic
Pr. vulgaris	шт. № 2-amylolitic	шт. № 9-amylolitic	шт. № 12-amylolitic
Ps. aeruginosa	шт. № 2-amylolitic	шт. № 9-amylolitic	шт. № 12-amylolitic
Str. pneumoniae	шт. № 2-amylolitic	шт. № 9-amylolitic	шт. № 12-amylolitic

Всего в опытах было использовано 15 чашек Петри. Наблюдение за ростом культур вели в течение 5 дней, замеры диаметра зон лизиса производили при помощи разработанной нами компьютерной программы для измерения морфометрических показателей. Контролем служили чашки Петри с питательной средой Сабуро, которые не содержали энтеропатогенные микроорганизмы, но в которые были засеян какой-либо из амилолитических штаммов.

Микроскопию и фотографирование изучаемого материала проводили при помощи микроскопа МИКМЕД-6 с тринокулярной насад-кой и цифрового фотоаппарата Canon-А520, имеющего программное обеспечение для компьютерной обработки получаемых изображений.

Результаты исследований. На рисунке 1 представлена чашка Петри со средой Сабуро, в которую была внесена культура кишечной палочки. Видны как единичные, так и разлитые колонии, которые являются результатом слияния мелких колоний в более крупные.

На рисунке 2 представлена чашка Петри со средой Сабуро, содержащей кишечную палочку и в которой методом лунок в 3 местах был посеян амилолитический штамм № 12.

Рис. 1. Среда Сабуро, содержащая колонии кишечной палочки (контроль)

Рис. 2. Зоны лизиса вокруг колоний амилолитического шт. № 12-amylolitic на среде Сабуро, содержащей кишечную палочку

Результаты исследований, характеризующие динамику образования зон лизиса вокруг колоний амилолитических штаммов в плот- ных питательных средах, в которых содержатся энтеропатогенные микроорганизмы, представлены в таблицах 2–4.

Таблица 2

Динамика изменения зоны лизиса вокруг культуры амилолитического шт. № 2-amylolitic на среде Сабуро, содержащей один из энтеропатогенных микроорганизмов, мм (M±m)

Дни культивирования	Вид энтеропатогенного микроорганизма, содержащегося в среде
	Escherichia coli	Salmonella dublin	Proteus vulgaris	Pseudomonas aeruginosa	Streptococcus pneumoniae
1	0	0	0	0	0
2	1,5±0,03	1,0±0,02	2,0±0,03	2,0±0,03	2,0±0,03
3	4,0±0,05	2,5±0,04	4,5±0,06	4,5±0,06	5,0±0,07
4	6,0±0,08	5,0±0,08	6,5±0,09	7,0±0,11	8,5±0,12
5	8,0±0,11	7,5±0,10	9,0±0,14	11,5±0,18	12,0±0,19

Таблица 3

Динамика изменения зоны лизиса вокруг культуры амилолитического шт. № 9-amylolitic на среде Сабуро, содержащей один из энтеропатогенных микроорганизмов, мм (M±m)

Дни культивирования	Вид энтеропатогенного микроорганизма, содержащегося в среде
	Escherichia coli	Salmonella dublin	Proteus vulgaris	Pseudomonas aeruginosa	Streptococcus pneumoniae
1	0	0	0	0	0
2	3,0±0,04	3,0±0,04	2,5±0,04	3,0±0,05	3,0±0,04
3	6,0±0,06	6,0±0,06	5,0±0,05	6,5±0,07	6,5±0,07
4	12,0±0,09	11,5±0,09	9,0±0,08	11,0±0,10	12,0±0,11
5	16±0,14	17,5±0,15	14±0,013	15,5±0,13	18,0±0,16

Таблица 4

Динамика изменения зоны лизиса вокруг культуры амилолитического шт. № 12-amylolitic на среде Сабуро, содержащей один из энтеропатогенных микроорганизмов, мм (M±m)

Дни культивирования	Вид энтеропатогенного микроорганизма, содержащегося в среде
	Escherichia сoli	Salmonella dublin	Proteus vulgaris	Pseudomonas aeruginosa	Streptococcus pneumoniae
1	0	0	0	0	0
2	3,5±0,05	4,0±0,06	4,5±0,06	5,0±0,07	5,0±0,08
3	8,0±0,09	9,0±0,10	12,0±0,11	14,0±0,14	14,5±0,15
4	11,5±0,11	14,0±0,14	19,5±0,18	20,0±0,18	21,0±0,19
5	17±0,15	19±0,18	25±0,22	27,0±0,25	28,0±0,28

Из данных таблиц 2–4 видно, что амилолитические микроорганизмы, засеянные на плотные питательные среды, в составе которых имелись различные виды энтеропатогенных бактерий, обладают различной антогонисти-ческой активностью по отношению к исследуемым видам энтеропатогенных бактерий. Наибольшие диаметры зон лизиса на 5-й день роста были отмечены вокруг культуры шт. № 12, меньше зоны лизиса были вокруг культуры шт. № 9 и наименьшие – вокруг культуры шт. № 2. При этом отмечено, что все амилолитические штаммы давали наибольшую зону лизиса при росте на среде с Str. pneumoniae, а наименьшую – S. dublin и E. Coli.

Выводы

• 1.    Амилолитические штаммы № 2, 9 и 2 микроорганизма Bacillus subtilis растут на плотных питательных средах, содержащих различные виды энтеропатогенных бактерий. Вокруг колоний амилолитических штаммов образуются зоны лизиса, что говорит о лизисе (гибели и растворении) энтеропатогенных бактерий вокруг растущих колоний амилолитических штаммов.

• 2.    Амилолитические штаммы № 2, 9 и 12 микроорганизма Bacillus subtilis обладают антагонистической активностью по отношению к таким видам энтеропатогенных бактерий, как Escherichia coli , Salmonella dublin , Proteus vulgaris , Pseudomonas aeruginosa и Streptococcus pneumoniae .

• 3.    По уровню антагонистической активности по отношению к энтеропатогенным бактериям амилолитические штаммы располагаются в следующем возрастающем порядке: № 2-amylolitic, № 9-amylolitic, № 12-amylolitic.

Предложение производству: использовать амилолитические штаммы № 2, 9 и 12 микроор- ганизма Bacillus subtilis в качестве пробиотиков для лечения и профилактики желудочнокишечных заболеваний, вызываемых энтеропа-тогенными бактериями.