Генетическая дифференциация популяций лиственницы сибирской (Larixsibirica ledeb.) по микросателлитных локусам

Ранее проблемы генетического разнообразия и дифференциации вида решались лишь с помощью изоферментных маркеров [Аллозимный полиморфизм..., 1989; Семериков, Матвеев, 1995; Semerikov, 1999; Ларионова, Яхнева (Орешкова), Кузьмина, 2003; Орешкова, Ларионова, 2006, 2007; Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010; Биоразнообразие лиственниц…, 2010 и др.]. Однако для адекватной количественной оценки генетического разнообразия этих данных не хватает, поскольку из-за специфики данного класса маркеров ускользает основная часть генома, а полученные показатели генетической изменчивости существенно занижены [Сулимова, 2004].

В последние годы для исследований генетического полиморфизма хвойных начали активно использовать представителей нового поколения ДНК-маркеров – микросателлиты (варьирующие участки ДНК, состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований), которые обладают высоким уровнем полиморфизма, большой частотой встречаются в геноме и достаточно равномерным распределением по длине генома.

Цель исследований. Используя ядерные молекулярные маркеры нового поколения, получить качественно новую информацию генетической изменчивости и уровня дифференциации лиственницы сибирской.

Объекты и методы исследований. В качестве объектов исследований взяты выборки из шести популяций лиственницы сибирской, произрастающие на территории Таймырского муниципального района Красноярского края и в Республиках Алтай и Тывы. Названия популяций и их местоположение представлены в табл. 1.

Таблица 1

Географическое расположение и характеристика исследованных популяций лиственницы сибирской

Популяция	Численность	Район расположения	Географические координаты	Высота над у.м., м
Республика Алтай
Черга	32	Шебалинский район Республики Алтай, окр. с. Черга	51°29'с.ш. 85°32'в.д.	600–650
Перевал	33	Шебалинский район Республики Алтай, окр. автодор. на Кукуй-ском перевале	51°27'с.ш. 85°15'в.д.	930-1200
Республика Тыва
Улар-1	30	Эрзинский район Республики Тыва, на север 32 км от с. Эрзин	50°27'с.ш. 95°30'в.д.	1873
Улар-2	30	Эрзинский район Республики Тыва, в 16–19 км севернее п. Морен	50°31'с.ш. 95°27'в.д.	2181
Таймырский район Красноярского края
Боганидское	30	Таймырский район Красноярского края, 26 км от г. Дудинка	69°20'с.ш. 86°52'в.д.	53
Талнах	30	Таймырский район Красноярского края, окр. п. Талнах	69°28'с.ш. 88°30'в.д.	70

Для выделения ДНК использовали хвою. Выделения проводили по стандартному протоколу для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (CTAB].

Полное отсутствие экспериментальных данных по изменчивости ядерных микросателлитных локусов у лиственницы сибирской явилось основной трудностью при подборе праймеров. Последовательности использованных в работе праймеров были взяты из литературных данных, где они использовались для анализа других видов рода Larix : лиственницы японской ( L. kaempferi Sarg. ) – группа bcLK [Isoda, Watanabe, 2006], лиственниц альпийской ( L. lyallii Parl. ) и западной ( L. occidentalis Nutt.) группы UAKLY [Isolation, characterization…, 2000; Contrasting microsatellite variation…, 2006] и UBCLX [Development and characterization of microsatellite, 2009]. Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси производства ООО «Лаборатория Изоген».

Характеристики микросателлитных локусов и условия ПЦР-амплификации приведены в табл. 2.

Таблица 2

Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости лиственницы сибирской

Локус	Мотив	tºC отжига	Число аллелей	Размер фрагмента	Источник литературы
bcLK056	(AG) 20	Touchdown 63–53ºС	21	142–196	Isoda, Watanabe, 2006
bcLK066	(TG) 12		8	143–157
bcLK189	(AG) 17 AT(AG) 6		23	158–202
bcLK224	(AG) 17		8	128–148
bcLK225	(GA) 20		28	160–224
bcLK232	(AG) 19		8	133–149
bcLK260	(TG) 14 (AG) 9		9	94–110
bcLK235	(TC) 9 (AC) 2 AG(AC) 14	58ºС	21	172–220
UBCLXtet_1-22	(TATC) 9 (TA) 12		6	176–186	Chen et al., 2009
UAKLly6	(GT) 17		23	214–262	Khasa et al., 2000, 2006

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6 %-м полиакриламидном геле с использованием Трис-EDTA-боратного электродного буфера. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и визуализировали с помощью системы гель-документации «Kodak». Молекулярный вес фрагментов определяли путем сопоставления со стандартными маркерами в программе Photo-Capt. Обработку полученных данных производили в программе GenAlEx 6.2 [Peakall, Smouse, 2006]. Для анализа связи между географическими и генетическими расстояниями использовали тест Мантела [Mantel, 1967].

Результаты исследований и их обсуждение. Из 10 проанализированных ядерных микросателлит-ных локусов у лиственницы сибирской все оказались полиморфными. Причем наиболее высокополиморфными оказались локусы bcLK056, bcLK189, bcLK225, bcLK235 и UAKLly6 , у которых наблюдалось от 21 до 28 аллелей. У остальных локусов ( bcLK066, bcLK224, bcLK232, bcLK260 , UBCLXtet_1-22 ) выявленный полиморфизм был сравнительно ниже. У них обнаружено от 6 до 9 аллельных варианта (табл. 2). В исследовании, включившем 185 проанализированных особей, по перечисленным локусам нуль-аллели выявлены не были. Всего при анализе шести популяций лиственницы сибирской было выявлено 155 аллельных варианта, из них около 22 % оказались уникальными, встречающиеся только в какой-либо одной из популяций.

При анализе показателей генетической изменчивости исследованных популяций лиственницы (табл. 3) выявили, что популяции из Республики Тыва в среднем характеризовались наиболее высоким аллельным разнообразием и уровнем наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (N a =9,6; H o =0,488±0,046; H e =0,673±0,054) по сравнению с алтайскими (N a =9,0; H o =0,409±0,054; H e =0,655±0,062) и таймырскими (N a =7,8; H o =0,478±0,035; H e =0,628±0,041).

Показатели генетической изменчивости лиственницы сибирской, рассчитанные по результатам микросателлитного анализа

Таблица 3

Популяции	N	N a	N e	H o	H e	F
Черга	32	9,2	5,310	0,416±0,073	0,663±0,088	0,347
Перевал	33	8,8	4,938	0,401±0,083	0,646±0,091	0,342
В среднем для района		9,0	5,124	0,409±0,054	0,655±0,062	0,344
Улар-1	30	9,6	4,788	0,510±0,058	0,695±0,061	0,261
Улар-2	30	9,6	5,341	0,467±0,074	0,651±0,093	0,239
В среднем для района		9,6	5,064	0,488±0,046	0,673±0,054	0,250
Боганидское	30	7,7	3,777	0,493±0,066	0,618±0,068	0,209
Талнах	30	7,9	3,459	0,463±0,051	0,639±0,052	0,262
В среднем для района		7,8	3,618	0,478±0,035	0,628±0,041	0,236
В среднем для изученных популяций		8,8 ±0,599	4,602 ±0,393	0,458 ±0,026	0,652 ±0,030	0,277 ±0,026

Примечание: N а – среднее число аллелей на локус; N е – эффективное число аллелей на локус; H о – наблюдаемая гетерозиготность; H е – ожидаемая гетерозиготность; F – индекс фиксации.

Установленные значения основных показателей генетического полиморфизма свидетельствуют о достаточно высоком уровне генетического разнообразия лиственницы сибирской в исследованных регионах (табл. 3) и находятся в пределах значений аналогичных показателей, рассчитанных для лиственниц японской, альпийской и западной [Contrasting microsatellite variation…, 2006; Isoda, Watanabe, 2006; Development and characterization…, 2009].

Сопоставление наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности показало, что во всех популяциях наблюдался дефицит гетерозиготных генотипов по большинству изученных микросателлитных локусов. Наиболее высокие значения индекса фиксации Райта (F) (табл. 3) были выявлены у популяций из Республики Алтай (F=0,344), а наименьшие у популяций из Таймыра (F=0,236). Это, по-видимому, можно объяснить большой фрагментированностью и низкой численностью популяций, а также самоопылением, приводящим к высокой степени инбридинга.

Исследование популяционной структуры с помощью F-статистик Райта [Wright, 1965; Guries, Ledig, 1982] показало, что каждое дерево в изученных популяциях лиственницы сибирской обнаруживает в среднем 29 %-й дефицит гетерозиготных генотипов (F is =0,293) относительно популяции и почти 36 % дефицит гетерозигот (F it =0,358) относительно вида (табл. 4).

Таблица 4 Значения показателей F-статистик Райта

Локус	F IS	F IT	F ST
bcLK232	0,372	0,408	0,058
bcLK056	0,240	0,303	0,083
bcLK224	0,405	0,424	0,033
bcLK225	0,324	0,370	0,068
bcLK066	0,150	0,183	0,039
bcLK189	0,378	0,401	0,037
bcLK260	0,311	0,395	0,122
bcLK235	0,187	0,237	0,061
UBCLXtet_1-22	0,257	0,487	0,310
UAKLly6	0,304	0,371	0,097
Среднее	0,293±0,026	0,358±0,029	0,091±0,026

Чуть более 9 % всей наблюдаемой изменчивости приходится на межпопуляционную (F ST =0,091). Внутри популяций сосредоточено 90,9 % всего генетического разнообразия. Максимально популяции дифференцированы по локусам UBCLXtet_1-22, bcLK260, UAKLly6 и bcLK056 .

На основании частот аллелей выявленных ядерных микросателлитных локусов проанализирована межпопуляционная дифференциация исследованных популяций лиственницы сибирской. В табл. 5 приведены показатели стандартных генетических расстояний М. Нея [Nei, 1972]. Генетическое расстояние D между популяциями колеблется от 0,067 до 0,469, составляя в среднем 0,254. Значения D слабо коррелировали с географическими расстояниями согласно тесту Мантела (r=0,552, P=0,07).

Таблица 5

Генетические расстояния D между изученными популяциями лиственницы сибирской

Черга	Перевал	Улар-1	Улар-2	Боганидское	Перевал
0,072	***
0,189	0,184	***			Улар-1
0,311	0,336	0,115	***		Улар-2
0,414	0,422	0,201	0,124	***	Боганидское
0,469	0,454	0,280	0,176	0,067	Талнах

Генетическая дифференциация исследованных популяций соответствует их географической удаленности друг от друга. Наименьшие генетические отличия установлены внутри каждого района исследований: между популяциями из Таймырского района (F ST =0,019; D=0,067), Республик Алтай (F ST =0,016; D=0,072) и Тыва (F ST =0,028; D=0,115). Наибольшая дифференциация выявлена между популяциями из разных районов: таймырские и алтайские выборки (F ST =0,095; D=0,439), таймырские и тувинские (F ST =0,043; D=0,195), а также алтайские и тувинские (F ST =0,058; D=0,255). Анализ генетических дистанций с помощью многомерного шкалирования (PCA) хорошо иллюстрирует это (рис.).

0,150

0,100

CM л 0,050

ГО s 0,000

Q.

О -0,050

-0,100

-0,150

♦ Улар-2 ♦ Улар-1

♦ Боганидское

♦ Талнах

♦ Черга ♦

Перевал

-0,300      -0,200      -0,100      0,000       0,100       0,200       0,300

Координата 1

Проекция изученных популяций лиственницы сибирской на плоскости двух координат по данным PCA-анализа (компьютерная программа GenAlEx V.6.2) матрицы генетических расстояний М. Нея

Таким образом, анализ генетических расстояний между популяциями показал отсутствие тесной взаимосвязи между географическим положением выборок и степенью их генетической дифференциации. Это объясняется тем, что лиственница сибирская произрастает в различных географических зонах с разнообразными экологическими условиями, образуя большое количество разновидностей, экотипов и климатипов. Влияние же экологических факторов перекрывает показатели генетической дифференциации. Подобные выводы были сделаны и по результатам изоферментного анализа [Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010].

Заключение. В результате проведенных исследований с использованием десяти ядерных микроса-теллитных локусов нами впервые были получены оценки уровня генетического разнообразия и дифференциации лиственницы сибирской из разных районов ее распространения по данным маркерам. Представленные данные являются лишь начальным этапом огромной работы по изучению генетического разнообразия не только вида, но и рода в целом, выявления диагностических локусов, маркирующих выборки, выделения генетических резерватов, изучения межвидовой гибридизации лиственниц.