Генетическая дифференциация популяций лиственницы сибирской (Larixsibirica ledeb.) по микросателлитных локусам
Автор: Орешкова Н.В., Белоконь М.М.
Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau
Рубрика: Экология
Статья в выпуске: 2, 2012 года.
Бесплатный доступ
Авторами статьи впервые исследована и применена на практике методика использования ядерных микросателлитных маркеров в анализе генетической изменчивости и уровня дифференциации лиственницы сибирской.
Лиственница сибирская, микросателлитные локусы, генетическое разнообразие и дифференциация, сохранение генофонда
Короткий адрес: https://sciup.org/14082211
IDR: 14082211
Текст научной статьи Генетическая дифференциация популяций лиственницы сибирской (Larixsibirica ledeb.) по микросателлитных локусам
Ранее проблемы генетического разнообразия и дифференциации вида решались лишь с помощью изоферментных маркеров [Аллозимный полиморфизм..., 1989; Семериков, Матвеев, 1995; Semerikov, 1999; Ларионова, Яхнева (Орешкова), Кузьмина, 2003; Орешкова, Ларионова, 2006, 2007; Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010; Биоразнообразие лиственниц…, 2010 и др.]. Однако для адекватной количественной оценки генетического разнообразия этих данных не хватает, поскольку из-за специфики данного класса маркеров ускользает основная часть генома, а полученные показатели генетической изменчивости существенно занижены [Сулимова, 2004].
В последние годы для исследований генетического полиморфизма хвойных начали активно использовать представителей нового поколения ДНК-маркеров – микросателлиты (варьирующие участки ДНК, состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований), которые обладают высоким уровнем полиморфизма, большой частотой встречаются в геноме и достаточно равномерным распределением по длине генома.
Цель исследований. Используя ядерные молекулярные маркеры нового поколения, получить качественно новую информацию генетической изменчивости и уровня дифференциации лиственницы сибирской.
Объекты и методы исследований. В качестве объектов исследований взяты выборки из шести популяций лиственницы сибирской, произрастающие на территории Таймырского муниципального района Красноярского края и в Республиках Алтай и Тывы. Названия популяций и их местоположение представлены в табл. 1.
Таблица 1
Географическое расположение и характеристика исследованных популяций лиственницы сибирской
Популяция |
Численность |
Район расположения |
Географические координаты |
Высота над у.м., м |
Республика Алтай |
||||
Черга |
32 |
Шебалинский район Республики Алтай, окр. с. Черга |
51°29'с.ш. 85°32'в.д. |
600–650 |
Перевал |
33 |
Шебалинский район Республики Алтай, окр. автодор. на Кукуй-ском перевале |
51°27'с.ш. 85°15'в.д. |
930-1200 |
Республика Тыва |
||||
Улар-1 |
30 |
Эрзинский район Республики Тыва, на север 32 км от с. Эрзин |
50°27'с.ш. 95°30'в.д. |
1873 |
Улар-2 |
30 |
Эрзинский район Республики Тыва, в 16–19 км севернее п. Морен |
50°31'с.ш. 95°27'в.д. |
2181 |
Таймырский район Красноярского края |
||||
Боганидское |
30 |
Таймырский район Красноярского края, 26 км от г. Дудинка |
69°20'с.ш. 86°52'в.д. |
53 |
Талнах |
30 |
Таймырский район Красноярского края, окр. п. Талнах |
69°28'с.ш. 88°30'в.д. |
70 |
Для выделения ДНК использовали хвою. Выделения проводили по стандартному протоколу для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (CTAB].
Полное отсутствие экспериментальных данных по изменчивости ядерных микросателлитных локусов у лиственницы сибирской явилось основной трудностью при подборе праймеров. Последовательности использованных в работе праймеров были взяты из литературных данных, где они использовались для анализа других видов рода Larix : лиственницы японской ( L. kaempferi Sarg. ) – группа bcLK [Isoda, Watanabe, 2006], лиственниц альпийской ( L. lyallii Parl. ) и западной ( L. occidentalis Nutt.) группы UAKLY [Isolation, characterization…, 2000; Contrasting microsatellite variation…, 2006] и UBCLX [Development and characterization of microsatellite, 2009]. Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси производства ООО «Лаборатория Изоген».
Характеристики микросателлитных локусов и условия ПЦР-амплификации приведены в табл. 2.
Таблица 2
Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости лиственницы сибирской
Локус |
Мотив |
tºC отжига |
Число аллелей |
Размер фрагмента |
Источник литературы |
bcLK056 |
(AG) 20 |
Touchdown 63–53ºС |
21 |
142–196 |
Isoda, Watanabe, 2006 |
bcLK066 |
(TG) 12 |
8 |
143–157 |
||
bcLK189 |
(AG) 17 AT(AG) 6 |
23 |
158–202 |
||
bcLK224 |
(AG) 17 |
8 |
128–148 |
||
bcLK225 |
(GA) 20 |
28 |
160–224 |
||
bcLK232 |
(AG) 19 |
8 |
133–149 |
||
bcLK260 |
(TG) 14 (AG) 9 |
9 |
94–110 |
||
bcLK235 |
(TC) 9 (AC) 2 AG(AC) 14 |
58ºС |
21 |
172–220 |
|
UBCLXtet_1-22 |
(TATC) 9 (TA) 12 |
6 |
176–186 |
Chen et al., 2009 |
|
UAKLly6 |
(GT) 17 |
23 |
214–262 |
Khasa et al., 2000, 2006 |
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6 %-м полиакриламидном геле с использованием Трис-EDTA-боратного электродного буфера. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и визуализировали с помощью системы гель-документации «Kodak». Молекулярный вес фрагментов определяли путем сопоставления со стандартными маркерами в программе Photo-Capt. Обработку полученных данных производили в программе GenAlEx 6.2 [Peakall, Smouse, 2006]. Для анализа связи между географическими и генетическими расстояниями использовали тест Мантела [Mantel, 1967].
Результаты исследований и их обсуждение. Из 10 проанализированных ядерных микросателлит-ных локусов у лиственницы сибирской все оказались полиморфными. Причем наиболее высокополиморфными оказались локусы bcLK056, bcLK189, bcLK225, bcLK235 и UAKLly6 , у которых наблюдалось от 21 до 28 аллелей. У остальных локусов ( bcLK066, bcLK224, bcLK232, bcLK260 , UBCLXtet_1-22 ) выявленный полиморфизм был сравнительно ниже. У них обнаружено от 6 до 9 аллельных варианта (табл. 2). В исследовании, включившем 185 проанализированных особей, по перечисленным локусам нуль-аллели выявлены не были. Всего при анализе шести популяций лиственницы сибирской было выявлено 155 аллельных варианта, из них около 22 % оказались уникальными, встречающиеся только в какой-либо одной из популяций.
При анализе показателей генетической изменчивости исследованных популяций лиственницы (табл. 3) выявили, что популяции из Республики Тыва в среднем характеризовались наиболее высоким аллельным разнообразием и уровнем наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (N a =9,6; H o =0,488±0,046; H e =0,673±0,054) по сравнению с алтайскими (N a =9,0; H o =0,409±0,054; H e =0,655±0,062) и таймырскими (N a =7,8; H o =0,478±0,035; H e =0,628±0,041).
Показатели генетической изменчивости лиственницы сибирской, рассчитанные по результатам микросателлитного анализа
Таблица 3
Популяции |
N |
N a |
N e |
H o |
H e |
F |
Черга |
32 |
9,2 |
5,310 |
0,416±0,073 |
0,663±0,088 |
0,347 |
Перевал |
33 |
8,8 |
4,938 |
0,401±0,083 |
0,646±0,091 |
0,342 |
В среднем для района |
9,0 |
5,124 |
0,409±0,054 |
0,655±0,062 |
0,344 |
|
Улар-1 |
30 |
9,6 |
4,788 |
0,510±0,058 |
0,695±0,061 |
0,261 |
Улар-2 |
30 |
9,6 |
5,341 |
0,467±0,074 |
0,651±0,093 |
0,239 |
В среднем для района |
9,6 |
5,064 |
0,488±0,046 |
0,673±0,054 |
0,250 |
|
Боганидское |
30 |
7,7 |
3,777 |
0,493±0,066 |
0,618±0,068 |
0,209 |
Талнах |
30 |
7,9 |
3,459 |
0,463±0,051 |
0,639±0,052 |
0,262 |
В среднем для района |
7,8 |
3,618 |
0,478±0,035 |
0,628±0,041 |
0,236 |
|
В среднем для изученных популяций |
8,8 ±0,599 |
4,602 ±0,393 |
0,458 ±0,026 |
0,652 ±0,030 |
0,277 ±0,026 |
Примечание: N а – среднее число аллелей на локус; N е – эффективное число аллелей на локус; H о – наблюдаемая гетерозиготность; H е – ожидаемая гетерозиготность; F – индекс фиксации.
Установленные значения основных показателей генетического полиморфизма свидетельствуют о достаточно высоком уровне генетического разнообразия лиственницы сибирской в исследованных регионах (табл. 3) и находятся в пределах значений аналогичных показателей, рассчитанных для лиственниц японской, альпийской и западной [Contrasting microsatellite variation…, 2006; Isoda, Watanabe, 2006; Development and characterization…, 2009].
Сопоставление наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности показало, что во всех популяциях наблюдался дефицит гетерозиготных генотипов по большинству изученных микросателлитных локусов. Наиболее высокие значения индекса фиксации Райта (F) (табл. 3) были выявлены у популяций из Республики Алтай (F=0,344), а наименьшие у популяций из Таймыра (F=0,236). Это, по-видимому, можно объяснить большой фрагментированностью и низкой численностью популяций, а также самоопылением, приводящим к высокой степени инбридинга.
Исследование популяционной структуры с помощью F-статистик Райта [Wright, 1965; Guries, Ledig, 1982] показало, что каждое дерево в изученных популяциях лиственницы сибирской обнаруживает в среднем 29 %-й дефицит гетерозиготных генотипов (F is =0,293) относительно популяции и почти 36 % дефицит гетерозигот (F it =0,358) относительно вида (табл. 4).
Таблица 4 Значения показателей F-статистик Райта
Локус |
F IS |
F IT |
F ST |
bcLK232 |
0,372 |
0,408 |
0,058 |
bcLK056 |
0,240 |
0,303 |
0,083 |
bcLK224 |
0,405 |
0,424 |
0,033 |
bcLK225 |
0,324 |
0,370 |
0,068 |
bcLK066 |
0,150 |
0,183 |
0,039 |
bcLK189 |
0,378 |
0,401 |
0,037 |
bcLK260 |
0,311 |
0,395 |
0,122 |
bcLK235 |
0,187 |
0,237 |
0,061 |
UBCLXtet_1-22 |
0,257 |
0,487 |
0,310 |
UAKLly6 |
0,304 |
0,371 |
0,097 |
Среднее |
0,293±0,026 |
0,358±0,029 |
0,091±0,026 |
Чуть более 9 % всей наблюдаемой изменчивости приходится на межпопуляционную (F ST =0,091). Внутри популяций сосредоточено 90,9 % всего генетического разнообразия. Максимально популяции дифференцированы по локусам UBCLXtet_1-22, bcLK260, UAKLly6 и bcLK056 .
На основании частот аллелей выявленных ядерных микросателлитных локусов проанализирована межпопуляционная дифференциация исследованных популяций лиственницы сибирской. В табл. 5 приведены показатели стандартных генетических расстояний М. Нея [Nei, 1972]. Генетическое расстояние D между популяциями колеблется от 0,067 до 0,469, составляя в среднем 0,254. Значения D слабо коррелировали с географическими расстояниями согласно тесту Мантела (r=0,552, P=0,07).
Таблица 5
Генетические расстояния D между изученными популяциями лиственницы сибирской
Черга |
Перевал |
Улар-1 |
Улар-2 |
Боганидское |
Перевал |
0,072 |
*** |
||||
0,189 |
0,184 |
*** |
Улар-1 |
||
0,311 |
0,336 |
0,115 |
*** |
Улар-2 |
|
0,414 |
0,422 |
0,201 |
0,124 |
*** |
Боганидское |
0,469 |
0,454 |
0,280 |
0,176 |
0,067 |
Талнах |
Генетическая дифференциация исследованных популяций соответствует их географической удаленности друг от друга. Наименьшие генетические отличия установлены внутри каждого района исследований: между популяциями из Таймырского района (F ST =0,019; D=0,067), Республик Алтай (F ST =0,016; D=0,072) и Тыва (F ST =0,028; D=0,115). Наибольшая дифференциация выявлена между популяциями из разных районов: таймырские и алтайские выборки (F ST =0,095; D=0,439), таймырские и тувинские (F ST =0,043; D=0,195), а также алтайские и тувинские (F ST =0,058; D=0,255). Анализ генетических дистанций с помощью многомерного шкалирования (PCA) хорошо иллюстрирует это (рис.).
0,150
0,100
CM л 0,050
ГО s 0,000
Q.
О -0,050
-0,100
-0,150
♦ Улар-2 ♦ Улар-1
♦ Боганидское
♦ Талнах
♦ Черга ♦
Перевал
-0,300 -0,200 -0,100 0,000 0,100 0,200 0,300
Координата 1
Проекция изученных популяций лиственницы сибирской на плоскости двух координат по данным PCA-анализа (компьютерная программа GenAlEx V.6.2) матрицы генетических расстояний М. Нея
Таким образом, анализ генетических расстояний между популяциями показал отсутствие тесной взаимосвязи между географическим положением выборок и степенью их генетической дифференциации. Это объясняется тем, что лиственница сибирская произрастает в различных географических зонах с разнообразными экологическими условиями, образуя большое количество разновидностей, экотипов и климатипов. Влияние же экологических факторов перекрывает показатели генетической дифференциации. Подобные выводы были сделаны и по результатам изоферментного анализа [Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010].
Заключение. В результате проведенных исследований с использованием десяти ядерных микроса-теллитных локусов нами впервые были получены оценки уровня генетического разнообразия и дифференциации лиственницы сибирской из разных районов ее распространения по данным маркерам. Представленные данные являются лишь начальным этапом огромной работы по изучению генетического разнообразия не только вида, но и рода в целом, выявления диагностических локусов, маркирующих выборки, выделения генетических резерватов, изучения межвидовой гибридизации лиственниц.