Генетическая дифференциация популяций лиственницы сибирской (Larixsibirica ledeb.) по микросателлитных локусам

Автор: Орешкова Н.В., Белоконь М.М.

Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau

Рубрика: Экология

Статья в выпуске: 2, 2012 года.

Бесплатный доступ

Авторами статьи впервые исследована и применена на практике методика использования ядерных микросателлитных маркеров в анализе генетической изменчивости и уровня дифференциации лиственницы сибирской.

Лиственница сибирская, микросателлитные локусы, генетическое разнообразие и дифференциация, сохранение генофонда

Короткий адрес: https://sciup.org/14082211

IDR: 14082211

Текст научной статьи Генетическая дифференциация популяций лиственницы сибирской (Larixsibirica ledeb.) по микросателлитных локусам

Ранее проблемы генетического разнообразия и дифференциации вида решались лишь с помощью изоферментных маркеров [Аллозимный полиморфизм..., 1989; Семериков, Матвеев, 1995; Semerikov, 1999; Ларионова, Яхнева (Орешкова), Кузьмина, 2003; Орешкова, Ларионова, 2006, 2007; Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010; Биоразнообразие лиственниц…, 2010 и др.]. Однако для адекватной количественной оценки генетического разнообразия этих данных не хватает, поскольку из-за специфики данного класса маркеров ускользает основная часть генома, а полученные показатели генетической изменчивости существенно занижены [Сулимова, 2004].

В последние годы для исследований генетического полиморфизма хвойных начали активно использовать представителей нового поколения ДНК-маркеров – микросателлиты (варьирующие участки ДНК, состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований), которые обладают высоким уровнем полиморфизма, большой частотой встречаются в геноме и достаточно равномерным распределением по длине генома.

Цель исследований. Используя ядерные молекулярные маркеры нового поколения, получить качественно новую информацию генетической изменчивости и уровня дифференциации лиственницы сибирской.

Объекты и методы исследований. В качестве объектов исследований взяты выборки из шести популяций лиственницы сибирской, произрастающие на территории Таймырского муниципального района Красноярского края и в Республиках Алтай и Тывы. Названия популяций и их местоположение представлены в табл. 1.

Таблица 1

Географическое расположение и характеристика исследованных популяций лиственницы сибирской

Популяция

Численность

Район расположения

Географические координаты

Высота над у.м., м

Республика Алтай

Черга

32

Шебалинский район Республики Алтай, окр. с. Черга

51°29'с.ш.

85°32'в.д.

600–650

Перевал

33

Шебалинский район Республики Алтай, окр. автодор. на Кукуй-ском перевале

51°27'с.ш.

85°15'в.д.

930-1200

Республика Тыва

Улар-1

30

Эрзинский район Республики Тыва, на север 32 км от с. Эрзин

50°27'с.ш.

95°30'в.д.

1873

Улар-2

30

Эрзинский район Республики Тыва, в 16–19 км севернее п. Морен

50°31'с.ш.

95°27'в.д.

2181

Таймырский район Красноярского края

Боганидское

30

Таймырский район Красноярского края, 26 км от г. Дудинка

69°20'с.ш.

86°52'в.д.

53

Талнах

30

Таймырский район Красноярского края, окр. п. Талнах

69°28'с.ш.

88°30'в.д.

70

Для выделения ДНК использовали хвою. Выделения проводили по стандартному протоколу для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (CTAB].

Полное отсутствие экспериментальных данных по изменчивости ядерных микросателлитных локусов у лиственницы сибирской явилось основной трудностью при подборе праймеров. Последовательности использованных в работе праймеров были взяты из литературных данных, где они использовались для анализа других видов рода Larix : лиственницы японской ( L. kaempferi Sarg. ) – группа bcLK [Isoda, Watanabe, 2006], лиственниц альпийской ( L. lyallii Parl. ) и западной ( L. occidentalis Nutt.) группы UAKLY [Isolation, characterization…, 2000; Contrasting microsatellite variation…, 2006] и UBCLX [Development and characterization of microsatellite, 2009]. Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси производства ООО «Лаборатория Изоген».

Характеристики микросателлитных локусов и условия ПЦР-амплификации приведены в табл. 2.

Таблица 2

Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости лиственницы сибирской

Локус

Мотив

tºC отжига

Число аллелей

Размер фрагмента

Источник литературы

bcLK056

(AG) 20

Touchdown 63–53ºС

21

142–196

Isoda, Watanabe, 2006

bcLK066

(TG) 12

8

143–157

bcLK189

(AG) 17 AT(AG) 6

23

158–202

bcLK224

(AG) 17

8

128–148

bcLK225

(GA) 20

28

160–224

bcLK232

(AG) 19

8

133–149

bcLK260

(TG) 14 (AG) 9

9

94–110

bcLK235

(TC) 9 (AC) 2 AG(AC) 14

58ºС

21

172–220

UBCLXtet_1-22

(TATC) 9 (TA) 12

6

176–186

Chen et al., 2009

UAKLly6

(GT) 17

23

214–262

Khasa et al., 2000, 2006

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6 %-м полиакриламидном геле с использованием Трис-EDTA-боратного электродного буфера. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и визуализировали с помощью системы гель-документации «Kodak». Молекулярный вес фрагментов определяли путем сопоставления со стандартными маркерами в программе Photo-Capt. Обработку полученных данных производили в программе GenAlEx 6.2 [Peakall, Smouse, 2006]. Для анализа связи между географическими и генетическими расстояниями использовали тест Мантела [Mantel, 1967].

Результаты исследований и их обсуждение. Из 10 проанализированных ядерных микросателлит-ных локусов у лиственницы сибирской все оказались полиморфными. Причем наиболее высокополиморфными оказались локусы bcLK056, bcLK189, bcLK225, bcLK235 и UAKLly6 , у которых наблюдалось от 21 до 28 аллелей. У остальных локусов ( bcLK066, bcLK224, bcLK232, bcLK260 , UBCLXtet_1-22 ) выявленный полиморфизм был сравнительно ниже. У них обнаружено от 6 до 9 аллельных варианта (табл. 2). В исследовании, включившем 185 проанализированных особей, по перечисленным локусам нуль-аллели выявлены не были. Всего при анализе шести популяций лиственницы сибирской было выявлено 155 аллельных варианта, из них около 22 % оказались уникальными, встречающиеся только в какой-либо одной из популяций.

При анализе показателей генетической изменчивости исследованных популяций лиственницы (табл. 3) выявили, что популяции из Республики Тыва в среднем характеризовались наиболее высоким аллельным разнообразием и уровнем наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (N a =9,6; H o =0,488±0,046; H e =0,673±0,054) по сравнению с алтайскими (N a =9,0; H o =0,409±0,054; H e =0,655±0,062) и таймырскими (N a =7,8; H o =0,478±0,035; H e =0,628±0,041).

Показатели генетической изменчивости лиственницы сибирской, рассчитанные по результатам микросателлитного анализа

Таблица 3

Популяции

N

N a

N e

H o

H e

F

Черга

32

9,2

5,310

0,416±0,073

0,663±0,088

0,347

Перевал

33

8,8

4,938

0,401±0,083

0,646±0,091

0,342

В среднем для района

9,0

5,124

0,409±0,054

0,655±0,062

0,344

Улар-1

30

9,6

4,788

0,510±0,058

0,695±0,061

0,261

Улар-2

30

9,6

5,341

0,467±0,074

0,651±0,093

0,239

В среднем для района

9,6

5,064

0,488±0,046

0,673±0,054

0,250

Боганидское

30

7,7

3,777

0,493±0,066

0,618±0,068

0,209

Талнах

30

7,9

3,459

0,463±0,051

0,639±0,052

0,262

В среднем для района

7,8

3,618

0,478±0,035

0,628±0,041

0,236

В среднем для изученных популяций

8,8 ±0,599

4,602 ±0,393

0,458 ±0,026

0,652 ±0,030

0,277 ±0,026

Примечание: N а – среднее число аллелей на локус; N е – эффективное число аллелей на локус; H о – наблюдаемая гетерозиготность; H е – ожидаемая гетерозиготность; F – индекс фиксации.

Установленные значения основных показателей генетического полиморфизма свидетельствуют о достаточно высоком уровне генетического разнообразия лиственницы сибирской в исследованных регионах (табл. 3) и находятся в пределах значений аналогичных показателей, рассчитанных для лиственниц японской, альпийской и западной [Contrasting microsatellite variation…, 2006; Isoda, Watanabe, 2006; Development and characterization…, 2009].

Сопоставление наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности показало, что во всех популяциях наблюдался дефицит гетерозиготных генотипов по большинству изученных микросателлитных локусов. Наиболее высокие значения индекса фиксации Райта (F) (табл. 3) были выявлены у популяций из Республики Алтай (F=0,344), а наименьшие у популяций из Таймыра (F=0,236). Это, по-видимому, можно объяснить большой фрагментированностью и низкой численностью популяций, а также самоопылением, приводящим к высокой степени инбридинга.

Исследование популяционной структуры с помощью F-статистик Райта [Wright, 1965; Guries, Ledig, 1982] показало, что каждое дерево в изученных популяциях лиственницы сибирской обнаруживает в среднем 29 %-й дефицит гетерозиготных генотипов (F is =0,293) относительно популяции и почти 36 % дефицит гетерозигот (F it =0,358) относительно вида (табл. 4).

Таблица 4 Значения показателей F-статистик Райта

Локус

F IS

F IT

F ST

bcLK232

0,372

0,408

0,058

bcLK056

0,240

0,303

0,083

bcLK224

0,405

0,424

0,033

bcLK225

0,324

0,370

0,068

bcLK066

0,150

0,183

0,039

bcLK189

0,378

0,401

0,037

bcLK260

0,311

0,395

0,122

bcLK235

0,187

0,237

0,061

UBCLXtet_1-22

0,257

0,487

0,310

UAKLly6

0,304

0,371

0,097

Среднее

0,293±0,026

0,358±0,029

0,091±0,026

Чуть более 9 % всей наблюдаемой изменчивости приходится на межпопуляционную (F ST =0,091). Внутри популяций сосредоточено 90,9 % всего генетического разнообразия. Максимально популяции дифференцированы по локусам UBCLXtet_1-22, bcLK260, UAKLly6 и bcLK056 .

На основании частот аллелей выявленных ядерных микросателлитных локусов проанализирована межпопуляционная дифференциация исследованных популяций лиственницы сибирской. В табл. 5 приведены показатели стандартных генетических расстояний М. Нея [Nei, 1972]. Генетическое расстояние D между популяциями колеблется от 0,067 до 0,469, составляя в среднем 0,254. Значения D слабо коррелировали с географическими расстояниями согласно тесту Мантела (r=0,552, P=0,07).

Таблица 5

Генетические расстояния D между изученными популяциями лиственницы сибирской

Черга

Перевал

Улар-1

Улар-2

Боганидское

Перевал

0,072

***

0,189

0,184

***

Улар-1

0,311

0,336

0,115

***

Улар-2

0,414

0,422

0,201

0,124

***

Боганидское

0,469

0,454

0,280

0,176

0,067

Талнах

Генетическая дифференциация исследованных популяций соответствует их географической удаленности друг от друга. Наименьшие генетические отличия установлены внутри каждого района исследований: между популяциями из Таймырского района (F ST =0,019; D=0,067), Республик Алтай (F ST =0,016; D=0,072) и Тыва (F ST =0,028; D=0,115). Наибольшая дифференциация выявлена между популяциями из разных районов: таймырские и алтайские выборки (F ST =0,095; D=0,439), таймырские и тувинские (F ST =0,043; D=0,195), а также алтайские и тувинские (F ST =0,058; D=0,255). Анализ генетических дистанций с помощью многомерного шкалирования (PCA) хорошо иллюстрирует это (рис.).

0,150

0,100

CM л 0,050

ГО s 0,000

Q.

О -0,050

-0,100

-0,150

♦ Улар-2 ♦ Улар-1

♦ Боганидское

♦ Талнах

♦ Черга ♦

Перевал

-0,300      -0,200      -0,100      0,000       0,100       0,200       0,300

Координата 1

Проекция изученных популяций лиственницы сибирской на плоскости двух координат по данным PCA-анализа (компьютерная программа GenAlEx V.6.2) матрицы генетических расстояний М. Нея

Таким образом, анализ генетических расстояний между популяциями показал отсутствие тесной взаимосвязи между географическим положением выборок и степенью их генетической дифференциации. Это объясняется тем, что лиственница сибирская произрастает в различных географических зонах с разнообразными экологическими условиями, образуя большое количество разновидностей, экотипов и климатипов. Влияние же экологических факторов перекрывает показатели генетической дифференциации. Подобные выводы были сделаны и по результатам изоферментного анализа [Орешкова, 2010; Орешкова, Барченков, 2010].

Заключение. В результате проведенных исследований с использованием десяти ядерных микроса-теллитных локусов нами впервые были получены оценки уровня генетического разнообразия и дифференциации лиственницы сибирской из разных районов ее распространения по данным маркерам. Представленные данные являются лишь начальным этапом огромной работы по изучению генетического разнообразия не только вида, но и рода в целом, выявления диагностических локусов, маркирующих выборки, выделения генетических резерватов, изучения межвидовой гибридизации лиственниц.

Статья научная