Идентификация антигенов и систем групп крови у различных видов животных

Для эволюционной генетики представляет интерес оценка филогенетического родства различных видов животных, происходящих от общего генетического корня, на основе использования известных маркирующих систем.

Серологические свойства некоторых антигенов эритроцитов животных и человека имеют сходство. В частности, обозначенные в разное время различными символами эритроцитарные антигены дают перекрестные реакции с антителами нормальных сывороток различных видов млекопитающих: А — человека и свиней, J — крупного рогатого скота, R — овец. Серологический анализ сходства антигенов у овец, коз и родственных им видов семейства Bovidae позволит проводить идентификацию групп крови у других видов жвачных (1-4).

В настоящее время известно об идентичности у крупного рогатого скота, зубра и их гибридов реакции по шести антигенам и наличии девяти сходных антигенов. У кавказских буйволов с помощью аллоиммунных сывороток крупного рогатого скота выявлено 18 антигенов, 9 из которых оказались серологически близкими с антигенами крупного рогатого скота. У яков, разводимых в Киргизии, посредством использования аллоим-мунных сывороток крупного рогатого скота обнаружено 19 антигенов, серологически сходных с антигенами последнего (5, 6).

Целью наших исследований была разработка метода идентификации антигенов и систем групп крови у различных видов жвачных (крупный рогатый скот, як, овца, коза, верблюд, сайгак и овцебык), а также оценка степени различий между животными этих видов по антигенам групп крови и характера наследования антигенов.

Описание методики. Для идентификации антигенов и систем групп крови мы провели аттестацию 183 коз оренбургской и зааненской пород, 56 калмыцких и казахских бактрианов (верблюдов), 14 яков и 14 овцебыков. При этом использовали моноспецифические сыворотки крупного рогатого скота, коз и овец — соответственно 60-66; 41 и 11 реагентов (11). Одновременно сыворотки крови яков, верблюдов, сайгаков и овцебыков проверяли на наличие специфических антител к тестированным эритроцитам крупного рогатого скота, овец и коз. Параллельно диагностикумами коз были тестированы 412 овец пород ромни-марш и цигайская по семи системам групп крови. При оценке групп крови жвачных использовали реакции как гемолиза и агглютинации (для эритроцитов овец, сайгаков, овцебыков и верблюдов), так и только гемолиза (для эритроцитов коз, крупного рогатого скота и яка). В качестве комплемента применяли абсорбированную эритроцитами каждого исследуемого вида свежую кроличью сыворотку (7).

Антисыворотки крупного рогатого скота были разделены на четыре группы по положительной реакции с эритроцитарными антигенами: I — A-, B-, C-, M-, S- и Z-системы у 1-20 коз (A, Z, G3, O3, Q, T1, T2, Y2, E'2, R2, X1, X2, C', M, S1, U", Z); II — B- и F-системы у 21-50 коз (P2, I', J'2, O', P', V); III — A-, B-, C- и J-системы у 51-105 коз (A2, B2, I2, O2, D, G", E, W, L', J); IV — вообще не реагирующие с эритроцитарными антигенами коз (G2, K, A'1, A'2, B', E'3, G', Q', Y', B", C1, G2, R1, F, L, S2, H', U, U', H" для идентификации антигенов B-, C-, F-, L-, S-систем групп крови). Детально были проанализированы реагенты,  дававшие полные и специфические  реакции в гемолитическом тесте (I2, P2', E2', У2), так как гемолиз наблюдался только при 119

взаимодействии с некоторыми эритроцитами коз. Проведенные абсорбция и семейный анализ подтвердили, что эти сыворотки содержат антитела одного типа, однако они оказались непригодными для последующей идентификации эритроцитарных антигенов овец и коз, вероятно, из-за незначительного сходства. Особенно четко это проявилось при исследовании триад отец—мать—потомок, так как сыворотки-реагенты не вступали в реакцию то с эритроцитами отца и матери, то с эритроцитами потомков.

Вместе с тем нами выявлена общность по 23 антигенам яка: антисыворотки A 1 , G 2 , K, I 2 , Y 1 , Y 2 , A' 1 , A' 2 , E' 2 , I', P' 1 , E, X 1 , X 2 , C'', L', V, J, L, H', Z, T', R', принадлежащие системам групп крови крупного рогатого скота A, B, C, F, J, L, S, Z, T', R' (за исключением системы М). Наибольшее число общих антигенов относилось к B-системе групп крови, наиболее полиморфной из всех известных систем у крупного рогатого скота.

Следует отметить, что большинство из 11 антисывороток овец (идентификация антигенов Aa, Ab, Bb, Be 1 , Ве 2 , Ca, Cb, Da, Ma, R и O) перекрестно реагировало с эритроцитарными антигенами коз, исключение составляли ареактивные антисыворотки Ab, Ве 2 , Da и О. В дальнейшем для типирования систем групп крови коз оренбургской и зааненской пород были использованы только антисыворотки-реагенты антигенов Аа (А-система); Bb, Bd, Bi, Be 1 (В-система), Са (С-система), Ма (М-система) и R (J) (R-система), проверенные контрольными абсорбциями и семейным анализом. Частота встречаемости антигенов, выявленная с помощью антисывороток-реагентов овец представлена в таблице 1. Данные, полученные на козах оренбургской и зааненской пород были сопоставлены с таковыми других авторов (5). Оказалось, что у коз локусы А-, С- и R-cистем групп крови имеют более простую структуру по сравнению с аналогичными локусами у овец, тогда как локус В-системы является таким же полиаллельным, как у крупного рогатого скота и овец. Мы получили антисыворотки-реагенты для идентификации антигенов систем групп крови А, В и С.

А - с и с т е м а. Антисыворотка для идентификации антигена Аа была получена в результате 4-кратного введения 20 мл донорской крови овце-реципиенту породы ромни-марш на племзаводе «Котовский» (Рязанская обл.), а также из ранее полученных «сырых» поливалентных сывороток овец, разводимых в Молдавии. Так, при анализе сыворотки ¹ 1 было установлено, что в ней содержится два различных антитела. Анализирующей абсорбцией эритроцитами подобранных животных удалось удалить ненужные антитела. Заключительную абсорбцию проводили при соотношении эритроцитов к поливалентной сыворотке 2:3 (см. табл. 1).

Первоначальные титры «сырых» сывороток (1:128 и 1:256) после 3-кратной абсорбции эритроцитами овец понизились в 2 раза (соответственно 1:64 и 1:128). Специфичность сывороток проверяли посредством постановки реакции гемолиза с эритроцитами не менее чем 40 аттестованных овец-доноров. У коз анализ на наличие антигена Аа проводили при рабочем разведении сывороток 1:4.

1. Характеристика моноспецифических антисывороток овец и крупного рогатого скота для идентификации антигенов систем групп крови коз

¹ сыворотки	Титр антител	Разведение антисыворотки для абсорбции	¹ овцы — донора эритроцитов	Количество эритроци-тов/объем сыворотки	Число анализов	Время абсорбции, мин	Полученная aнти-сыворотка	Источник получения антисыворотки
1	1:32	1:4	697	2:3	3	45	Aa	S
90018	1:128	1:4	68	1:4	1	45	Bb	S
545	1:128	1:8	456	2:3	2	45	Bd	S
113	1:64	1:3	161	1:7	2	30	Be 1	S
133	1:128	1:5	195	2:3	3	45	Bi	S
G20	1:32	1:4	03428	1:3	2	45	Ca	G
57	1:8	1:2	55	1:10	1	10	R	BNS
К-1	1:8	1:2	3452	1:10	1	10	R	GNS
О-21	1:4	Н	4217	1:15	1	10	R	SNS

П р и м е ч а н и е. G и S — аллоиммунные сыворотки соответственно коз и овец; BNS, GNS и SNS —естественные антитела соответственно крупного рогатого скота, коз и овец.

В - с и с т е м а (наиболее сложная из всех известных систем групп крови у коз) имеет сходство с В-системами групп крови крупного рогатого скота и овец (3, 8). Антитела для идентификации антигенов этой системы были выделены из аллоиммунных поливалентных сывороток овец, разводимых в Молдавии. Для получения антисыворотки для идентификации антигена Bb донором служили овцы цигайской породы, а реципиентом гибриды F1 цигайская ½ остфризская породы. В результате проведения 4-кратной иммунизации и соответствующей абсорбции эритроцитами из иммунной сыворотки овцы-реципиента ¹ 90018 удалось выделить антитело для типирования антигена Bb (см. табл. 1).

Титр сыворотки при разведении составлял 1:128, то есть налицо эффект «прозоны», что характерно для «высокотитражных» сывороток, которые при малых разведениях не дают реакции или наблюдается незначительный гемолиз. Особенно наглядно эффект «прозоны» проявился при реакции эритроцитов овец ¹¹ 2, 5 и 13 (табл. 2). Эту сыворотку мы использовали в рабочем разведении 1:16-1:32.

2. Оценка специфичности антисыворотки для идентификации антигена Bb коз

¹ донора	Эритроциты, содержащие антигены Bb	Титр абсорбированной сыворотки ¹ 90018
		Н	1:2    1	1:4	1:8    1	1:16	1:32   1	1:64     1	1:128
1	–
2	Bb	2 2 3	3 3 4	4 4 4	4 4 4	4 4 4	4 4 4	4 4 4	2 2 3
4 5 6	– Bb –	1 2 3 –	– –	– –	– –	– –	– –	– –	– –
78 9 10	– – Bb –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 4 4 4 –	– 3 3 4 –
11 12	– –	–	–	–	–	–	–	–	–
13 14	Bb	1 2 2	2 2 3	4 4 4	4 4 4	4 4 4	4 4 4	4 4 4	3 3 4
15	–	–	–	–	–	–	–	–	–

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает отсутствие антигена.

Реагент для идентификации антигена Bd получен из «сырой» сыворотки при внутрипородной иммунизации овец породы ромни-марш на племзаводе «Котовский» (Рязанская обл.). Наряду с ожидаемым антителом в поливалентной сыворотке оказались еще неизвестные иммуноглобулины, которые были удалены специально подобранными эритроцитами овцы ¹ 456. Титр сыворотки до абсорбции составлял 1:128, после завершения обработки — 1:32; при аттестации животных использовали рабочее разведение 1:4.

Анализ показал, что полученная антисыворотка подходит для идентификации антигенов Ве 1 , но не обладает специфичностью для выявления Ве 2 -антигенов. Оценку эффективности антисыворотки для идентификации антигенов Ве 1 проводили по триаде отец—мать—потомок (табл. 3). Пять потомков получили аллель Ве 1 от отца, у остальных трех особей аллель отсутствовал. Это свидетельствует о гетерозиготности самца-производителя по аллелю Ве₁.

3. Характер наследования антигенов Ве1, Вe2 и Bе (Bе1+Ве2) в потомстве козла-производителя с генотипом Ве1/В0 У коз отмечена средняя частота встречаемости антигена Bi. Нам не удалось выявить аналог антитела Bi в исследо-ванных антисыворотках у коз, поэтому была Антиген Матки коз Потомство использована            иммунная Be Be1     Be2 Be Be1 Be2 – –      – – – – антисыворотка     овец,     после – –      – + + — соответствующей        дочист-ки – – –      – –      – – + – + – — отмытыми эритроцитами коз. – –      – – – – При иммунизации четырех овец – –      – + + + + — породы ромни-марш удалось получить – –      – – – – антисыворотку к антигену Вс, однако для П р и м е ч а н и е. (+) и (–) — соответственно выявления аналога этого антигена у коз положительная и отрицательная реакция . требуется      проведение      серии экспериментов.

С - с и с т е м а коз аналогична таковой овец и крупного рогатого скота (3, 8). Антиген Са относится к сильным иммуногенным факторам крови и у коз, поэтому нам не представляло никакого труда получить для его идентификации соответствующую поливалентную сыворотку, а затем соответствующий реагент (см. табл. 3).

Проведенный сравнительный анализ сывороток-реагентов на овцах и козах выявил общность антигенов Са (овцы) и G20 (козы), что предполагает наличие общей системы у этих видов животных. Реагент, специфичный для коз, представляет собой аллоиммунную сыворотку, полученную от одного реципиента — козы оренбургской породы.

В настоящее время исследования эритроцитарных антигенов у коз проводятся в лабораториях семи стран мира (Швейцария, Франция, Германия, США, Норвегия, Австралия и Российская Федерация). При этом было обнаружено шесть, а по данным австралийских ученых — девять систем групп крови (3, 9, 10). По предварительным данным, у коз выявлено 15 кластеров по 41 диагностикуму и пять локусов систем групп крови (A, B, C, M, R), аналогичных таковым у овец (11). Однако необходимы дальнейшие исследования по конкретизации систем групп крови у коз.

В 1986 году был проведен единственный сравнительный тест, главной целью которого было установление международных творческих связей между заинтересованными лабораториями для дальнейшей совместной работы (12). К сожалению, продолжения не последовало, что связано с высокой стоимостью сравнительных испытаний. Вместе с тем такая аттестация является необходимой, исходя из следующих соображений: отбор и унификация реагентов, использование отчетов сравнительных международных испытаний в качестве законного документа, фиксирующего работу лабораторий в других странах, а также как форма обмена информацией.

Известно, что моноспецифичность сывороток, согласно существующим правилам, должна быть подтверждена в одном из научно-исследовательских центров по изучению групп крови животных (МОГЖ). Такая аттестация является необходимой, так как при этом не только официально оценивается полученный реагент, но и работа лаборатории, где он произведен. Обычно по согласованию с МОГЖ институт какой-либо страны рассылает в лаборатории других стран образцы крови 40 животных. В этих образцах определяют группы крови сыворотками, полученными в лаборатории, и сообщают результаты проверяющей организации, которая обобщает данные и сообщает их всем исполнителям. На очередной конференции МОГЖ проводят оценку и унификацию сывороток, лучшие из которых становятся международными стандартами. Одна из важнейших задач на ближайшую перспективу — это пополнение банка реагентов для оценки групп крови коз, создание новых антисывороток для обнаружения неизвестных антигенов и генетических систем.

Располагая рядом сывороток-реагентов, пригодных для оценки групп крови как овец, так и коз, мы провели популяционно-генетический и семейный анализ образцов крови коз по триаде отец—мать—потомок. В результате по триаде была выявлена идентичная антигенная специфичность и различие по структуре систем. Полностью идентичными с учетом антигенов, аллелей и генотипов оказались J- и R-системы групп крови крупного рогатого скота, яка и коз. Каждая из этих двух систем была представлена одним антигеном (J, R), двумя фенотипами (J, J^o; R, R⁰), двумя аллелями ( J J , J⁰ ; R R , R⁰ ), тремя генотипами (J^jJ^j, J^jJ^o, J^oJ^o; R^rR^r, R^rR^o, R^oR^o). Аналогичные данные получены при семейном анализе по А- и С-системам групп крови.

¹ по томка

Фенотип отца, гетерозиготный по А-, В-, Си R-системам групп крови

4. Характер наследования эритроцитарных антигенов A-, B-, C- и R-систем групп крови при генотипе отца A a/о , B^b/d, C^a/o, R^r, R^o

	Аа	Bb	Bd	Ca	R
1	Aa	Bb	–	Ca	R
2	–	–	Bd	–	–
3	–	Bb	–	–	–
4	–	–	Bd	Ca	R
5	Aa	Bb	–	–	R
6	–	–	Bd	–	R
7	Aa	–	Bd	Ca	–
8	–	Bb	–	–	–
9	Aa	–	Bd	–	–
10	–	Bb	–	Ca	–
11	–	–	Bd	Ca	R
12	–	Bb	–	–	R

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает отсутствие реакции.

Анализ эритроцитов отца и его потомства по четырем системам групп крови свидетельствует о независимой передаче антигенов отдельных систем групп крови у коз (табл. 4). Вместе с тем, несмотря на гомологичность антигенов R и J, структура локусов у домашних овец и коз сильно различалась. Так, R-антиген у овец проявлялся у генотипов RRII, RRIi,

RrII и RrIi. состоянии

При гомозиготном

гена

i

наблюдался эпистаз

в

(локус    I )

отношении

антигенов системы R. Кроме того, ген i у овец аналогичным образом

дей-ствует и на положенный также отсутствующий у

доминирует рецессивное

над

О-антиген, рас-в R-локусе, но коз. Антиген R О. Доминантно-

отношение у коз

отмечалось в 100 % случаев в открытых системах, когда аллель Bb доминировал над аллелем Bo.

При исследовании крови 412 овец породы ромни-марш и цигайской нами также не подтверждена гомология с антигенами I2, B', P'2 крупного рогатого скота и Bb, Bd и Bc овец, что согласуется с данными других авторов (3, 13).

Что касается эритроцитов крови верблюда, сайгака и овцебыка, то нами не выявлено реакции ни с одной иммуноспецифической сывороткой-реагентом крупного рогатого скота, коз и овец, что свидетельствует об отсутствии каких-либо общих антигенов. Вместе с тем из 41 исследованного реагента две антисыворотки коз (С15 и С16) в виде агглютининов и одна (С21) в виде гемолизина четко реагировали с эритроцитами крови сайгаков. Это, однако, не позволяет говорить об общности антигенов между этими двумя видами, так как, возможно, мы имеем дело с неспецифическими агглютининами и гемолизином, которые не удалось удалить методом анализирующей абсорбции.

У овец и коз было выявлено восемь общих антигенов (Aa, Bb, Bd, Be1, Bi, Ca, Ma, R) по пяти системам (A, B, C, M, R) из семи локусов, унифицированных МОГЖ. У коз отсутствовали реакции с антигенами D- и I-систем крови овец. Данные анализа крови коз оренбургской и зааненской пород позволяют рассматривать возможность использования антигенов четырех систем групп крови в качестве дополнительных тест-систем при аттестации животных этого вида по группам крови (табл. 5).

5. Частота встречаемости антигенов у коз разных пород, выявленная с помощью сывороток-реагентов овец

Антиген	Порода коз
	оренбургская	зааненская	альпийская*	зааненская*
Аа	0,125	0,030	0	0,061
Bb	0,775	0,020	0,058	0,273
Bd	0,250	0,110	0,175	0,283
Вe (Be 1 )	0,450	0,500	0,573	0,707
Bi	0,150	0,120	0,437	0,354
Ca	0,175	0,480	0,796	0,778
R	0,450	0,430	0,398	0,636
* Цит. по 3 ист.

Из антисывороток коз подходящими для проведения исследований у овец оказались только три: Са, R и О. Нативную антисыворотку коз можно использовать в качестве источника антител O и R для выявления R- и О-антигенов R-системы у овец и R-антигена R-системы у коз.

Таким образом, полученные результаты по общности антигенов овец и коз позволили нам при аттестации различных пород и помесей коз использовать восемь антисывороток овец; для аналогичных анализов у овец пригодными были только три антисыворотки коз.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    T u c k e r E.M., Cl a r k e S.W. Comparative aspects of biochemical polimorphism in the blood of Caprinae and their hybrids. Anim. Blood Group s Biochem. Genet., 1980, II, 3: 163 -183.

• 2.    C о р о к о в о й П.Ф., Б у к а р о в Н.Г., З а г д с у р е н Е. Группы крови у монгольского скота, яков и гибридов. Генетика, 1982, 2: 306-312.

• 3.    N g u y e n T.C. Genetic systems of red cell blood groups in goats. Animal Genetics, 1990, 21 : 133 -245.

• 4.    М a r z a n o v N.S., I o l c h i e v B.S., M a r z a n o v a L.K. e.a. Genetic markers at goats. XXVII Intern. Conf. on Animal Genetics. Minneapolis, USA, 2000: 4.

• 5.   G a s p a r s k y J. The futher investigations of the Wisents and hybrids red cell antigens. In:

• 6.   С о р о к о в о й П.Ф., Б ы к о в ч е н к о Ю.Г. Видовые особенности антигенов групп крови

  крупного рогатого скота и яка. В кн.: Вопросы биохимической генетики человека и сельскохозяйственных животных. Самарканд, 1973, 249, 77.

• 7.  М а р з а н о в Н.С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз. Кишинев, 1991.

• 8.   R a s m u s e n B.A. Blood groups in sheep. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1962, 97: 306-319.

• 9.   V а n k a n D.M., B e l l K. Caprine blood groups. 1. The B system. Biochemical Genetics, 1993a,

• 10.    V a n k a n D.M., B e l l K. Caprine blood groups. 2. The C, G, H, I, J, K, L, N and Q systems. Biochemical Genetics, 1993b, 31, 1/2: 19-28.

• 11.    М а р з а н о в а Л.К. Иммунобиотехнологические свойства крови и молока у коз. Автореф. канд. дис. Дубровицы, 2002.

• 12.  Report on the 1986 Goat Comparison Test. Animal Genetics, 1987, 18, 1: 100-101.

• 13.  Z u r T., Z u r F. Wstepne wyniki badan nad otrzymaniem surowic testowych do oznaczania grup

  krwi u owiec. In: Zeszyty problemowe postepow nauk rolniczych. Krakow, 1976, 180: 225-260.

Polymorphysms biochimiques des animaux. X Congr. European sur les Groups Sangins. Paris, 1967.

31, 1/2: 7-17.

Всероссийский НИИ животноводства,