Экстракция ароматических аминокислот поли-N-винилпирролидоном-3500

Ароматические аминокислоты участвуют во всех жизненных процессах наряду с нуклеиновыми кислотами, углеводами и липидами. Потребность в значительных количествах незаменимых аминокислот и общеукрепляющих, оздоровительных, питательных добавок на их основе неуклонно возрастает в связи с их широким применением в биохимии, пищевой и медицинской промышленности и сельском хозяйстве, а также при исследовании растительных и животных тканей [1-3].

Сложности возникают при исследовании культуральных сред и аминокислотных препаратов, представляющих собой многокомпонентные системы, содержащие большое количество примесных и балластных веществ. В таких системах затруднено препаративное разделение и концентрирование ароматических аминокислот. Это приводит к ограничению возможностей применения хроматографических и спектральных методов анализа.

Перспективным направлением в решении такой задачи является использование в экстракционных системах водорастворимых высокомолекулярных соединений [4].

В последние годы химия поли-N-виниламидов интенсивно развивается и интегрируется во многие области науки, включая медицину и биотехнологию. Водораствори-мость, биосовместимость, нетоксичность, термочувствительность в водных растворах и высокая комплексообразующая способность - такие свойства поли-N-виниламидов определяют перспективы их практического применения.

Известно, что двухфазные водные системы на основе водорастворимых полимеров наиболее полно удовлетворяют требованиям, предъявляемым к экстракционным системам. Водорастворимые полимеры, как правило, не токсичны, нелетучи, легко доступны и обладают повышенной комплексообразующей способностью по отношению ко многим биологически активным веществам [5].

Высокая экстрагирующая эффективность таких систем позволяет применять их для пробоподготовки широкого круга объектов - лекарственных препаратов сложного состав, пищевых продуктов, кормов, экстрактов биологических жидкостей.

Цель исследования - изучение экстракции фенилаланина, тирозина и триптофана по-ли-N-винилпирролидоном-3500, установление общих характеристик процесса.

Изучено извлечение фенилаланина, тирозина и триптофана из водных растворов по-ли-N-винилпирролидоном-3500.

ПВП-3500 - аморфный полимер белого цвета, легко растворим в воде, хлороформе, этиловом спирте, практически нерастворим в ароматических углеводородах и кетонах.

CH   CH 2

поли-N-винилпирролидон

Взаимодействует со многими низко- и высокомолекулярными соединениями в водных растворах, способен к комплексообразованию с разными органическими и неорганическими веществами. Эта способность расширяет области практического применения полимера в различных отраслях [6].

Жидкостная двухфазная система получена на основе водного раствора полиэлектролита и высаливателя. При этом одна из фаз насыщается полимером, вторая - солью.

После экстракционного извлечения и разделения органических соединений, как правило, проводят анализ водного концентрата различными физико-химическими методами. Для установления количества, чистоты и подлинности различных органических соединений в растворах применяется УФ-спектроскопия.

Спектры светопоглощения регистрировали на спектрофотометре DR-5000 (кварцевая кювета, толщина светопоглощающего слоя 1 см).

Общую последовательность операций анализа можно представить следующей схемой (рисунок 1).

Рисунок 1. Схема анализа и определения аминокислот

В идентичных условиях установлены коэффициенты распределения ( D ), рассчитана степень извлечения ( R, % ).

Разработана методика экстракционного извлечения ароматических аминокислот с последующим спектрофотометрическим определением аналитов.

Навеску фенилаланина, тирозина и триптофана фармакопейной чистоты с массами соответственно 0,035 г, 0,0075 г и 0,0035 г отбирали на аналитических весах, помещали в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводили до метки насыщенным раствором высаливателя.

В качестве высаливателя применяли сульфат аммония. Этот электролит оказывает наибольшее высаливающее действие по отношению к ароматическим аминокислотам, значительно повышает количественные характеристики экстракции (коэффициент распределения D и степень извлечения R , %).

Для экстракционного извлечения фенилаланина, тирозина и триптофана применяли карбоцепной полимер поли-N-винилпирролидон (ПВП) со средневязкостной молекулярной массой 3500.

В градуированные пробирки с пришлифованными пробками помещали 10 см³ раствора аминокислоты, 4 см³ водного раствора полимера ( С = 0,12 г/см³) и экстрагировали 10 минут на вибросмесителе. Этого времени достаточно для установления межфазного равновесия. Для ускорения расслаивания системы экстракты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут. Температурный интервал при экстракции устанавливали на уровне 21 ± 1 °С (термостат ТВ-20-ПЗ).

Концентрацию индивидуальных аминокислот после экстракции рассчитывали на основании данных спектрофотометрического определения при соответствующих длинах волн.

В водном растворе поли-N-виниламиды и вода образуют полимерный комплекс, каждая >С=О группа капролактамового или пирролидонового кольца ассоциируется с молекулами воды. Образующийся гидратный слой вблизи полимерной цепи состоит из 4-х молекул воды и 2-х звеньев полимера [7].

Изучена экстракция фенилаланина, тирозина и триптофана из водного раствора сульфата аммония (ранее установлено, что в присутствии этого высаливателя достигаются максимальные экстракционные характеристики витаминов) поли-N-винилпирролидоном [8]. Максимальные экстракционные характеристики аминокислот в присутствии сульфата аммония обусловлены вытеснением сульфат-ионами воды из гидратного слоя полимера.

Установлено, что на степень извлечения фенилаланина, триптофана и тирозина значительное влияние оказывает соотношение объемов водной и органической фаз (f) вследствие их высокой взаимной растворимости фаз (рисунок 2). Зависимость степени извлечения тирозина в системах с ПВП-3500 от соотношения объемов равновесных фаз свидетельствует о наибольшей эффективности систем со значением f 10:4.

Вязкость раствора полимера и скорость расслаивания с растворами солей зависят от молекулярной массы полимера и его концентрации в системе. Концентрация полимера изменялась в интервале 0,05-0,15 г/см3. Предварительные исследования показали, что при увеличении концентрации выше 0,15 г/см3 образуются ассоциаты полимера, при этом освобождается связанная вода, которая переходит в равновесную водно-солевую фазу.

Рисунок 2. Зависимость степени извлечения тирозина от соотношения объемов равновесных фаз при экстракции ПВП-3500 в присутствии сульфата аммония

В результате соотношение объемов равновесных фаз остается постоянным и коэффициенты распределения витаминов с увеличением концентрации полимера свыше 0,15 г/см3 возрастают незначительно.

Максимальные экстракционные характеристики аминокислот достигаются при концентрации ПВП-3500 0,12 г/см3.

Приводим экстракционные характеристики фенилаланина, тирозина и триптофана в системах с поли-N-винилпирролидоном при различной конц ентрации модельных растворов аминокислот (таблица 1).

Максимальная степень извлечения фенилаланина при однократной экстракции в присутствии сульфата аммония - 90 %, триптофана - 94 %, тирозина - 92%. Очевидно, на межфазное распределение аминокислот существенное влияние оказывает строение их молекул, наличие в структурах функциональных групп, способных образовывать внутри- и межмолекулярные водородные связи.

Образование комплекса полимера с аминокислотой происходит за счет водородных связей между атомом кислорода полимера (неспаренная пара электронов) и атомом водорода в структуре аминокислоты через «мостик» воды [8]:

Таблица 1

Экстpaкционныe xapaктеристики при извлечении фенилaлaʜиʜa, триптофaʜa и тирозиʜa ΠBΠ-3500 при paзличной концентpaции aминокислот f= 10:4 ; n= 4; P= 0,95

С, мг/см3	D	R,%
Фенилaлaʜин
0,10	12± 1,2	81
0,15	13± 0,8	84
0,20	10± 2,3	80
0,25	14± 1,8	85
0,30	18± 0,9	88
0,35	23 ± 1,4	90
0,40	17± 2,7	87
0,45	13± 3,1	84
0,50	17± 2,9	87
Триптофaʜ
0,05	17± 1,3	87
0,055	19± 2,2	88
0,060	19± 2,2	88
0,065	25± 3,1	91
0,070	28± 1,2	92
0,075	36 ± 2,1	94
0,080	30± 2,5	93
0,085	28± 2,9	92
0,090	31± 1,8	93
Тирозин
0,005	14± 1,4	85
0,010	12± 1,6	83
0,015	17± 1,8	87
0,020	15± 2,1	86
0,025	18± 1,5	88
0,030	21± 2,3	89
0,035	28 ± 2,3	92
0,040	25± 1,7	91
0,045	23± 2,4	90

Для количественного определения aми-нокислот в водныx pacтʙopax и оргaʜической фaзе предʙapительно построены спектpaльныe xapaктеристики полимepa (рисунок 3) и водно-гo pacтʙopa aминокислот (рисунок 4).

Рисунок 3. УФ-спектр светопоглощения поли-N-

винилпирролидoʜa; λ мax = 194 нм

Ha ocʜoʙaʜии мaксимумов светопогло-щения можно предположить, что при взaимо-действии ПВП-3500 c apoмaтическими aмино-кислотaми обpaзуются комплексы, оптически е свойстʙa которых отличaются от исходных компонентов [9 ].

Рисунок 4. УФ-спектры светопоглощения фенил-aлaʜиʜa (1), тирозиʜa (2) и триптофaʜa (3) в водном pacтʙope

Ha УФ-спектpax cʙeтопоглощения систем ПВП-3500 и aминокислот в совместном присутствии проявляются мaксимумы свето-поглощения индивидyaльных компон ентов (рисунок 5).

Рисунок 5. УФ-спектр светопоглощения смеси триптофaʜ - поли-N-винилпирролидон

На межфазное распределение и эффективность экстракции ароматических аминокислот влияет молекулярная масса полимера, в зависимости от которой аминокислоты после экстракции содержатся в разных фазах [10].

Установлено, что применение полимера с меньшей молекулярной массой приводит к более высоким экстракционным характеристикам, поэтому в предлагаемых нами системах достигает- ся практически полное извлечение ароматических аминокислот при однократной экстракции.