Определение антиоксидантной активности молочно-растительного экстракта методом жидкостной хроматографии

Антиоксидантной активностью характеризуются токоферолы ( а-, в-, Y—, 8 -изомеры), аскорбиновая кислота, аскорбаты натрия, кальция и калия, изоаскорбиновая кислота, лактат калия, кверцетин, дигидрокверцетин (производные флавонов), лимонная и винная кислоты, фермент глюкозооксидаза.

Применение природных антиоксидантов, которые являются полезными добавками, представляется наиболее перспективным для ингибирования окислительных процессов по сравнению с их синтетическими аналогами.

В настоящее время все большее внимание привлекает подсластитель натурального происхождения – якон [1]. Корнеплоды якона содержат большой спектр олигофруктанов, а также моносахариды (в основном глюкозу и фруктозу), сахарозу, 60-70 % сухого вещества представлено инулином. Из минеральных веществ корнеплоды якона содержат азот и фосфор, магний, натрий, кальций, железо, цинк,

медь, калий. Основными азотсодержащими компонентами являются амиды и аминокислоты как в свободном состоянии, так и в составе белка. Кроме того, корнеплоды якона содержат соединения, характеризующиеся антиоксидантной активностью, а также способны накапливать селен до 1,1 мг/кг.

Экстрагирование – один из перспективных способов извлечения компонентов, характеризующихся антиоксидантными свойствами, которые тормозят процессы окисления, протекающие в клетках. В качестве экстрагента применен ультрафильтрат творожной сыворотки.

Цель работы – определить антиоксидантную активность полученного молочнорастительного экстракта якона.

Нами предлагается в качестве экстрагента ультрафильтрат творожной сыворотки – продукт фракционного разделения молочной сыворотки, полученный нами на ультрафильтрационной установке с мембранами типа ОПМ-450С. Он содержит значительное количество лактозы (около 90 % от общего содержания сухих веществ), аминокислоты, низкомолекулярные белковые вещества, молочную кислоту, макро- и микроэлементы, жиро- и водорастворимые витамины. По органолептическим показателям ультрафильтрат творожной сыворотки представляет собой прозрачную желтую жидкость с более высокой биологической и коллоидной стабильностью, чем творожная сыворотка.

Молочно-растительный экстракт получали по следующей методике. Клубни якона измельчали до 2 мм и сушили при 60 °С до содержания сухих веществ на уровне 6 – 7 мас. %, добавляли экстрагент – ультрафильтрат творожной сыворотки (соотношение объемов твердой и жидкой фаз 1 : 6 и подкисляли раствором гидрокарбоната натрия или лимонной кислоты до рН 4,4, кислотность экстрагента контролировали потенциометрически. Экстрагировали на вибросмесителе при 60 °С. В течение 60 мин достигалось максимальное содержание сухих веществ в экстракте. Затем проводили двухступенчатую очистку экстракта путем его пропускания через колонку, заполненную активированным углем.

Определение антиоксидантной активности выполняли в окислительном режиме амперометрическим методом на жидкостном хроматографе «ЦветЯуза-01-АА».

Амперометрический метод – единственный непосредственно измеряющий содержание всех антиоксидантов в пробе. Метод отличается высокой селективностью определения только в отношении антиоксидантов [24]. Другие методы – непрямые, предназначены для измерения ингибирования реакционных смесей, генерируемых определенными реакциями. Методом восстановления Fe3+ до Fe2+ (FRAP) также можно определять суммарное содержание антиоксидантов, однако он не предназначен для детектирования всех антиоксидантов, в частности, тиолов, так как их восстановительный потенциал значительно ниже потенциала превращения Fe3+ до Fe2+ [5].

Настоящая методика выполнения измерений предназначена для измерения содержания антиоксидантов (СА) в водорастворимых БАДах, напитках (соках, чае, винах, пиве, квасах, бальзамах, коньяках), экстрактах растений в диапазоне 0,2 – 4,0 мг кверцетина (стандарта)/дм3. В случае, если измеренная величина СА превышает 4,0 мг/дм3, предусматривается разбавление пробы бидистилла-том до 1000 раз.

Величина СА образцов определяется содержанием в них природных флавоноидов, в частности, катехинов (вещества группы флавана); кверцетина, рутина, дигидрокверцетина (вещества группы флавона); а также витаминов и других соединений, способных связывать свободные радикалы.

Для определения антиоксидантов в экстракте измеряли величину тока, возникающего при окислении антиоксиданта на поверхности стеклоуглеродного электрода. Полученный сигнал сопоставляли со стандартом (дигидрокверцетин), измеренным в тех же условиях. Величина тока зависит от природы анализируемого объекта и приложенного потенциала.

Условия измерений: температура (25 + 10) ^оС, напряжение переменного тока 220 В, частота тока (50 ± 1) Гц.

Предварительно готовили элюент (2,2 мМ раствор ортофосфорной кислоты) и стандартные растворы дегидрокверцетина с концентрациями 0,5; 1,0; 1.5;    2,0; 3,0

и 3,5 мг/дм3.

Высокая чувствительность определения, низкий остаточный ток и хорошая воспроизводимость аналитического сигнала наблюдаются на стеклоуглеродном электроде, выбранном в качестве рабочего [6]. Для построения градуировочного графика устанавливали потенциал +1,3 В. Скорость потока элюента 1,2 см3/мин. Применяли дегидрокверцетин квалификации ч.д.а. Серию растворов готовили по навеске и с последующим разведением дистиллированной водой. Построение градуировочной функции проводили по 6 водным растворам дегидрокверцетина, величину тока которых измеряли по 3 раза.

Строили градуировочную функцию методом наименьших квадратов (рис. 1). Полученный график описывается уравнением прямой, достоверность аппроксимации 0, 9938:

Y = 0,00037405· X + 0,1861 , где Х – сигнал кверцетина (площадь выходной кривой), нА·с; Y – концентрация раствора дегидрокверцетина, мг/дм³.

Рис. 1. Градуировочный график для определения антиоксидантной активности

Окисление антиоксиданта происходит на поверхности стеклоуглеродного электрода, потенциал которого при этом возрастает.

Вольтамперометрическое окисление молочно-растительного экстракта представлено на рис. 2: τ – продолжительность анализа (время выхода) экстракта, полученного из клубней якона, с; I – величина аналитического

Т а б л и ц а

Показания анализатора «ЦветЯуза-01-АА» при анализе экстракта якона

Номер пика	Время выхода пробы, c	Полуширина пика, c	Высота пика, нА	Площадь пика, нА∙c
1	23,61	10,74	589,82	6333,55
2	77,31	10,46	578,47	6049,58
3	132,08	10,54	567,10	5974,53
4	191,04	10,35	568,40	5882,67
5	258,89	10,32	573,76	5921,23
Среднее результатов измерений				6032,31

По результатам измерений вычисляли среднее арифметическое площади пиков (таблица). Из полученных значений высот пиков следует, что относительная погрешность измерений не превышает 5 %.

Антиоксидантную активность экстракта (СА) вычисляли по уравнению:

СА = Саг ∙ N, где Саг – содержание антиоксидантов, найденное по градуировочному графику, мг/дм3 (рис. 1) ; N – кратность разбавления экстракта.

Y = 0,00037405·6032,31 + 0,1861 = 2,44 мг/дм3, с учетом 50-кратного разбавления получаем концентрацию раствора дегидрокверцетина Y = 2,44·50 = 122 мг/дм3.

Метод жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием – универсальный метод определения антиоксидантной активности [7-9]. Анализ легко выполним, высокочувствителен, требует минимального расхода реактивов. Относительная погрешность – не более 5 % при доверительной вероятности 0,95.

Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что молочно-растительный экстракт проявляет антиоксидантную активность по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Значение суммарного содержания природных антиоксидантов позволяет рекомендовать экстракт для антиоксидантной терапии, а также для создания новых продуктов с повышенной антиоксидантной активностью.