Разработка элементов методики апомиктического размножения селекционно ценных образцов капусты кочанной

Апомиксис – природное явление, заключающееся в развитии зародыша из яйцеклетки или другой клетки зародышевого мешка при отсутствии опыления. Такой тип апомиксиса называется партеногенезом или апогамией и встречается в природе с достаточно низкой частотой проявления (10-6) [1]. В последнее время исследователями предпринимаются попытки индуцировать нерегулярный апомиксис у важнейших сельскохозяйственных растений. К сожалению, у большинства из них почти полностью отсутствует способность к апогамии. Согласно литературным данным у капусты кочанной удалось получить пар- теногенетические семена после экзогенной обработки неоплодотво-ренных завязей фитогормонами или их синтетическими аналогами, дей- ствие которых заключалось в стимуляции митотического деления и удвоения числа хромосом неоплодот-воренных яйцеклеток [2, 3]. Этими же авторами было показано, что на фенотипическое проявление партеногенеза в значительной степени влияет генотип растения, фаза развития зародышевого мешка, вид фитогормонов, их весовые соотношения в апомиктическом агенте для обработки и нормы расхода данного агента на одну неоплодотворенную яйцеклетку [2-4]. Учитывая литературные данные, в задачу наших исследований входила эксперимен- тальная проверка уже предложенных методик индуцирования нерегулярного апомиксиса капусты кочанной и возможная их оптимизация в случае получения отрицательного результата при использовании на наших растительных объектах.

Материалы и методы

Для получения апомиктических семян капусты кочанной использовались элементы методик, предложенные в работах [2, 4]. В качестве объектов исследований были использованы семенники капусты белокочанной сортов Лазурная, Лика, Леся, Белоснежка, Яна, Харьковская зимняя и капусты краснокочанной сорта Палета. В опыте изучались семенники капусты на начальном периоде фазы цветения (распускание цветков на главном стебле и осях первого порядка верхнего яруса). Для получения апомиктических семян первоначально проводилась процедура кастрации бутонов полностью сформированных цветков за 2-3 суток до их раскрытия. Кастрированные бутоны обрабатывали модифицированными вариантами апомиктического агента (АГ), в основе которого было обязательное присутствие водной смеси регуляторов роста – гиббереллина (ГК3) и цитокинина (БАП) с добавлением других биологически-активных веществ. Перед нанесением АГ у кастрированных бутонов обрабатывали рыльца и пестики 96%-водным раствором этилового спирта для удаления на их поверхности случайно попавшей пыльцы капусты. Затем с помощью микропипетки на основание пестиков наносили 10 мкл АГ. Процедуру кастрации проводили в утренние часы суток (7-10 ч.). Обработанные, таким образом, репродуктивные побеги с кастрированными бутонами изолировали от остальных пергаментными изоляторами до времени полной потери восприимчивости рыльца к пыльце капусты на

8-10 суток. На семенниках, с обработанными АГ бутонами, оставляли стебли, на которых проходило свободное опыление цветков капусты насекомыми. После удаления изоляторов проводили фенологические наблюдения за ростом стручков и формированием апомиктических семенных зародышей в течение всего периода роста семенников до полного вызревания семян капусты, которые образовывались в результате свободного внутрисортового опыления.

Результаты и их обсуждение

В 2006 году были начаты исследования по индукции нерегулярного апомиксиса на экспериментальной базе Института овощеводства и бахчеводства НААН. При использовании методических рекомендаций по обработке АГ кастрированных бутонов цветков, предложенных в работах [2, 4], по истечении срока вызревания семенников в наших опытах наблюдали формирование только бессемянных стручков у всех изученных сортов капусты кочанной. Согласно данных вышеуказанных литературных источников на капусте белокочанной удалось получить патреногенетические семе-

Рис. 1. Результаты биометрических измерений (в световом поле бинокуляра) длины 10 рендомизировано отобранных апомиктических зародышей капусты кочан-

ной разных сортов, проведенные в конце периода созревания семенников (дан-

ные 2007 года).

123456789 10 11 12

на при обработке АГ, содержащем водный раствор гиббереллина (ГК3) [2] или гиббереллина (ГК3) и цитокинина (БАП) [4].

В 2007 году был расширены поисковые работы по оптимизации компонентного состава АГ. В отличие от предыдущего года в работе использовали следующие варианты обработки кастрированных бутонов:

• 1)    АГ № 1 – водная смесь ГК₃ и

• БАП (контроль);

• 2)    АГ № 2 – водная смесь ГК₃, БАП и препарата Марс-El;

• 3)    АГ № 1 с дополнительным одновременным нанесением на рыльце инородной пыльцы несовместимых с капустой кочанной видов растений семейства крестоцветные;

• 4)    АГ № 2 с дополнительным одновременным нанесением на рыльца инородной пыльцы несовместимых с капустой кочанной видов растений семейства крестоцветные.

В результате проведенных исследований были выделены, как наиболее перспективные для дальнейшей работы 3-й и 4-й варианты обработки, при использовании которых был обнаружен эффект кратковременного роста апомиктических семенных

Сорта капусты кочанной.

• к I Лазурная < вар 1)

• Q 2. Тика (вар 1)

• 0 5. X зимняя (вар !)

В 3 Белоснежка (ва)) 1)

В 4 Яна (вар 1)

• 9 6 Палета (вар 1)

я7 Лазурная (вар.З)

S 8 Лика (вар 3)

Q 9. Белоснежка (вар 3)

S 10 Яна (вар.З)

• § 11 X зимняя (вар 3)

• в 12 Палета (вар.З)

зародышей в стручках всех задействованных в эксперименте сортовых генотипов капусты кочанной. После эмпирического перебора был обнаружен вид растения семейства Brassicaceae – подвид китайской редьки Лоба (Convar lobo Sazon) вида Raphanus sativus L., пыльца с растений которой обеспечивала вышеуказанный прирост. В частности, в наших экспериментах использовали сорт Трояндовая селекции ИОБ НААН вышеуказанного подвида редьки.

На рис. 1 представлены результаты биометрических измерений длины семенных апомиктических зародышей у сортов капусты кочанной, которые были задействованы в 1-м и 3-м вариантах опыта. Из полученных данных следует, что синергическая обработка АГ № 1 и пыльцой редьки Лоба (3-й вариант) стимулирует частичный рост зародышей, увеличивая их размер в 1,8-2 раза, по сравнению с обработкой только АГ № 1 (1-й вариант). На рис. 2 показаны фотографии сформированных стручков с недоразвитыми зародышами, которые были получены во 2м и 4-м вариантах обработки семенников сорта капусты краснокочанной Палета.

В общем, если использовали для обработки АГ № 1 или АГ № 2 (1-й и 2-й варианты обработки), то при этом наблюдали исключительно пар-тенокарпический рост стручков без роста зародышей. Использование препарата Марс-El в смеси с фито-гормональными регуляторами было обусловлено его функциональной особенностью, как пленкообразующего и водоудерживающего вещества для сохранения на более длительное время на поверхности пестика капли водной смеси ГК3 и БАП [5]. Однако в дальнейших опытах было обнаружено негативное действие данного препарата на органогенез семенных зародышей, поэтому он был исключен из работы.

В 2008 году использовали следу- ющие варианты обработки кастрированных бутонов:

• 1)    АГ № 1 – водная смесь ГК₃ и

• БАП (контроль);

• 2)    АГ № 2 – АГ №1 с дополнительным одновременным нанесением на рыльце пыльцы редьки сорта Трояндовая;

• 3)    АГ № 3 – водная смесь ГК₃, БАП и регулятора ДГ-475(12) с дополнительным одновременным нанесением на рыльце пыльцы редьки сорта Трояндовая.

При использовании 1-го варианта обработки мы наблюдали только партенокарпический рост стручков. По результативности выделили 2-й и 3-й варианты обработки. Как и в опыте 2007 года, при применении 2-го варианта у сортов Лика, Белоснежка, Яна, Харьковская зимняя обнаружен эффект кратковременного роста апомиктических зародышей. В отличие от предыдущих лет исследований были увеличены репрезентативные выборки бутонов по каждому сорту капусты кочанной (на одном семеннике 10-15 образцов в

Рис. 2. Временная стимуляция формирования апомиктических зародышей в 4-м варианте и ее отсутствие во 2-м варианте опыта по индукции нерегулярного апомиксиса (растения репродуктивной фазы развития сорта капусты краснокочанной Палета, данные 2007 года):

1) 4-й вариант обработки (нанесение на пестики АГ № 2 и пыльцы дикой редьки на рыльца кастрированных бутонов);

2) 2-й вариант обработки (нанесение на пестики АГ № 2).

2006-2007 годах и 50-70 образцов в 2008 году). В результате во 2-м варианте обработки у сорта капусты белокочанной Леся было обнаружено формирование апомиктических семян (14 образцов, частота образования 25,6 %) и у сорта Лазурная – 2 образца (частота образования 2,9 %). Применение АГ № 3, также, оказалось эффективным на сорте капусты краснокочанной Палета (прирост семенных зародышей в 3-3,5 раза больший по сравнению с вариантом обработки АГ № 1). Данный экспериментальный факт свидетельствует о довольно существенном влиянии генотипа сорта на фитогормональный состав АГ, обнаружено избирательное позитивное действие на данный сорт капусты препарата ДГ-475 (12), который является химическим соединением, производным пиридина. ДГ-475 (12) ранее использовали мы в опытах по культуре протопластов капусты белокочанной in vitro, как регулятор, инициирующий и поддерживающий митотическую активность соматических клеток [6]. Аналогично предыдущим годам исследований, в 2008 году АГ № 1 не обнаружил высокой стимулирующей активности, поэтому в дальнейшем был исключен из работы.

В 2009 году использовали такие же модификации компонентного состава АГ, как и в 2008 году (только 2й и 3-й варианты обработки). Получены партеногенетические семена сорта капусты белокочанной – Яна (4 семени, частота образования 3,2 %). Позитивное регуляторное действие на формирование апомиктических семян имела синергическая обработка кастрированных бутонов АГ №3 и пыльцой растений редьки сорта Трояндовая.

Опыты 2010 года оказались неудачными вследствие неблагоприятных климатических условий, которые сложились в период вызревания семенников капусты. В течение мая-июня месяца были отмечены высокие дневные температуры воздуха до 40оС. При такой высокой температуре пыльца китайской редьки Ло-ба теряла свою фертильность, что негативно сказалось на завязывании партеногенетических семян капусты кочанной.

Как правило, полностью сформированные партеногенетические семена завязывались в проксимальной части (по отношению к столбику) за- вязи в количестве 1-2 экземпляров на стручок (рис. 3.). Все апомиктические семена показали 100 % всхожесть в лабораторных условиях при проращивании в чашках Петри на влажных фильтровальных мостиках.

Рис. 3. Сформированное партеногенетическое семя в проксимальной части завязи

(сорт капусты белокочанной Лазурная, опыт 2008 года)

Заключение и выводы

В результате проведенных исследований выявлены экзогенные факторы, влияющие на проявление нерегулярного апомиксиса у капусты кочанной. Из семи изученных сортов партеногенетические семена были получены у трех сортов капусты кочанной – Яна, Лазурная и Леся с разной частотой формирования в зависимости от генотипа сорта. Действием экзогенных факторов удалось индуцировать незавершенный органогенез партеногенетических семян у всех остальных сортов капусты кочанной. Проявление нерегулярного апомиксиса было вызвано синергическим воздействием фито-гормональных регуляторов и чужеродной пыльцы при условии одновременного нанесения водной смеси гиббереллина и цитокинина на основание пестика, а чужеродной пыльцы (китайской редьки Ло-ба) – на рыльца пестиков кастрированных бутонов капусты за 2-3 суток до их раскрытия.