Ассоциация экспрессии интегрина альфа-6/бета-4 и ламинина-332 с лимфогенным метастазированием при люминальном А раке молочной железы

Актуальность

Критически важным направлением современной онкологии является обеспечение эффективного лечения с сохранением качества жизни, в связи с чем в клиническую практику активно внедряются органосохраняющие операции [1]. При раке молочной железы (РМЖ) данный метод реализуется стремлением к выполнению резекции молочной железы вместо мастэктомии, а также избирательным подходом к лимфодиссекции, которая сопряжена с риском лимфедемы, длительной лим-фореи, а также с возможными неврологическими нарушениями или с ограничением подвижности в плечевом суставе. Однако при выполнении органосохраняющих операций возникает риск рецидивов. В настоящее время наиболее точным методом оценки состояния регионального лимфатического бассейна является исследование сторожевого лимфоузла, однако в 5–10 % случаев метод дает ложноотрицательные результаты [2]. В связи с этим актуальным является поиск дополнительных точных параметров, позволяющих определять риск лимфогенного метастазирования и состояние лимфатических узлов на дооперационном этапе с целью определения показаний к лимфодиссекции.

Перспективным кандидатом для решения этих задач является интегрин альфа-6/бета-4, который в нормальных тканях в составе гемидесмосом обеспечивает прочную связь эпителия с базальной мембраной. В то же время установлено, что экспрессия интегрина альфа-6/бета-4 играет роль в прогрессировании рака, выступая стимулятором инвазии и метастазирования [3, 4]. Рецептором интегрина альфа-6/бета-4 является ламинин-332, состоящий из альфа-3, бета-3 и гамма-2 цепей. В норме ламинин-332 экспрессируется в базальной мембране и удерживает эпителий на месте, но в опухоли превращается в «трамплин» для приобретения клетками способности к инвазии и метастазированию. В норме ламинин-332 не экспрессируется в эпителиальных клетках. Эпителиальные клетки экспрессируют ламинин-332 при репаративной регенерации эпителиальной ткани, например при заживлении ран. В опухолевой ткани экспрессия ламинина-332 наблюдается в инвазивном фронте и рассматривается как маркер эпителиально-мезенхимального перехода [5, 6].

Цель исследования – изучить особенности экспрессии интегрина альфа-6/бета-4 и его лиганда ламинина-332 при лимфогенном метастазировании люминального А рака молочной железы.

Материал и методы

В исследование включено 110 больных люминальным А раком молочной железы T1–2N0–3M0, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского

НИМЦ в период с 2016 по 2022 г. Стадирование выполнялось с использованием классификации TNM Международного союза по противораковому контролю (8-е издание, 2017 г.). Предоперационного лечения больные не получали. До операции всем больным выполнялась биопсия первичной опухоли. Оперативное вмешательство выполнялось в объеме мастэктомии или секторальной резекции с подмышечной лимфаденэктомией.

Морфологическому исследованию подвергался операционный материал. Фиксация и проводка материала осуществлялись по стандартной методике. Светооптическая микроскопия выполнялась с использованием микроскопа Axio Lab.A1 (Сarl Zeiss, Германия). Учитывались гистологический вариант опухоли, степень злокачественности, состояние краев резекции, выраженность лимфоваскулярной, периневральной инвазии, состояние подмышечных лимфоузлов. Гистологический тип опухоли устанавливался на основании Международной гистологической классификации рака молочной железы Всемирной организации здравоохранения (2019 г.). В исследование включали только случаи с инвазивной протоковой карциномой, неспецифицированной.

Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартной методике с использованием иммуногистостейнера Bond-maX (Leica, Германия). Применялись антитела к Estrogen receptor (клон 1D5, Dako, Дания), Progesteron receptor (клон PgR636, Dako, Дания), c-erB-2 (HER2/ neu) (Polyclonal Rabbit, Dako, Дания), Ki67 (клон SP6, Cell Marque, Германия), к Laminin gamma-2 Monoclonal Antibody (CL2980) (моноклональные, мышиные, разведение 1:500, Invitrogen, США), ITGA6 Polyclonal Antibody (поликлональные, мышиные, разведение 1:200, Elabscience, Китай), Integrin beta 4 Ab – AF5346 – 100ul (человеческие, мышиные, крысиные, разведение 1:200, Affinity Biosciences, Китай), рекомбинантное моноклональное антитело к Ламинину гамма-2 (Lg2) [CL2980] (разведение 1:500, Invitrogen, США). Гистологические препараты оцифровывали методом полного сканирования среза с применением автоматизированной сканирующей системы Pannoramic MIDI c программным обеспечением Pannoramic Digital Scanner Software 3.0.7-MIDI (3D HISTECH, Венгрия) в режиме расширенного фокуса с объективом х40. Для выполнения пространственного анализа срезы сканировали в режиме Z-Стек с захватом 30 уровней и размером шага 1 мкм. Анализ отсканированных срезов проводился с применением программного обеспечения SlideViver V2.8 и приложения QuantCenter.

Молекулярно-биологический тип рака молочной железы устанавливали на основании результата иммуногистохимического исследования биоптатов. Оценку экспрессии рецепторов к эстрогенам (РЭ) и к прогестерону (РП) осуществляли по методу Allred

[7]. Для определения экспрессии HER2 выполнялась оценка мембранного окрашивания клеток в инвазивном компоненте опухоли [8, 9]. Индекс Ki67 устанавливался на основании определения процента опухолевых клеток с позитивным ядер-ным окрашиванием любой интенсивности в общем среднем значении с учетом всей площади опухоли [10]. С учетом экспрессии РЭ, РП, HER2 и Ki67 определялся молекулярно-биологический подтип РМЖ [11]. В исследование включали только случаи с люминальным А молекулярно-биологическим подтипом. В операционном материале оценивали степень дифференцировки опухоли, наличие лимфоваскулярной и периневральной инвазии краев резекции, проводили патоморфологическое стадирование с характеристикой первичной опухоли (рT) и регионарных лимфатических узлов (рN). Больные были разделены на две группы: без лимфогенных метастазов (n=81) и с лимфогенными метастазами (n=29) (табл. 1).

В оцифрованных препаратах из нормальной ткани молочной железы вне опухоли, ткани первичной опухоли и лимфогенных метастазов оценивали наличие, процент, интенсивность и локализацию экспрессии субъединицы интегрина альфа-6 (ITGA6) и субъединицы интегрина бета-4 (ITGB4), гамма-2 субъединицы ламинина-332 (LAMG2) (табл. 2). Уточнения локализации экспрессии выполняли с применением пространственного анализа. Статистическую обработку выполняли с применением пакета программ Statisticа 10.0. Для проверки нормальности распределения показателей использовался критерий Шапиро–Вилка. Учитывая ненормальное распределение изучаемых количественных признаков, оценка достоверности различий медиан для сравнения двух независимых групп проводилась с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Сравнение частоты выявления признаков выполнялось с использованием критерия χ2. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Экспрессия ITGA6 и ITGB4 в ткани молочной железы вне опухоли обнаруживалась во всех случаях в люминальном и базальном эпителии протоков, при этом экспрессия ITGA6 была выражена умеренно, а экспрессия ITGB4 – слабо (рис. 1 – 1А, 1Б). Экспрессия LAMG2 также выявлялась во всех случаях и локализовалась в базальной мембране протоков (рис. 1 – 1В). Для уточнения локализации экспрессии изучаемых маркеров выполнялся пространственный анализ. При этом экспрессия ITGA6 и ITGB4 обнаруживалась в мембране и цитоплазме эпителиальных клеток, а экспрессия LAMG2 – в базальной мембране протоков (рис. 1 – 2А, 2Б, 2В).

Исследование экспрессии маркеров в ткани первичной опухоли осуществлялось по операционному материалу (рис. 2 – 1А, 1Б, 1В). Для

Таблица 1/table 1

Клинико-морфологическая характеристика сравниваемых групп больных clinical and morphological characteristics of the patients

Группа/Group

Параметр/Parameter          Без лимфогенных метастазов/       С лимфогенными метастазами/        p

Without lymph node metastases (n=81) With lymph node metastases (n=29)

уточнения локализации экспрессии изучаемых маркеров в опухолевых клетках выполнялся пространственный анализ. Экспрессия ITGA6, ITGB4 и LAMG2 была мембранной (рис. 2 – 2А, 2Б, 2В). Частота случаев с наличием в первичной опухоли опухолевых клеток с позитивной экспрессией ITGA6 не различалась в группах больных с на-

личием и отсутствием лимфогенных метастазов (79 и 74 %). Иная картина обнаруживалась при исследовании экспрессии ITGВ4. Данный маркер чаще экспрессировался в опухолевых клетках первичной опухоли у больных с лимфогенными метастазами (66 %) в сравнении с группой без таковых (19 %; χ2=22,088; р<0,001). Подобного

Возраст, лет/Age, years Me [Q1; Q3]	53,0 [46,0; 62,0]	56,0 [60,0; 54,0]	0,396
Менструальная функция/Menstrual function
Есть/Yes Нет/No	40 (49 %) 41 (51 %)	12 (41 %) 17 (59 %)	0,459
рТ
рТ1 рТ2	44 (54 %) 37 (46 %)	7 (24 %) 22 (76 %)	0,005
Степень злокачественности/Grade
Степень 1/Grade 1 Степень 2/Grade 2 Степень 3/Grade 3	18 (22 %) 61 (75 %) 2 (3 %)	3 (10 %) 26 (90 %) 0 (0 %)	0,241
Лимфоваскулярная инвазия/Lymphovascular Invasion
Нет/No Есть/Yes	72 (89 %) 9 (11 %)	18 (62 %) 11 (38 %)	0,001
Периневральная инвазия/Perineural invasion
Нет/No Есть/Yes Примечание: таблица составлена авторами.	78 (96 %) 3 (4 %)	26 (89 %) 3 (11 %)	0,176

Note: created by the authors.

Таблица 2/table 2

Характеристика экспрессии itga6, itgВ4 и laMg2 в опухолевых клетках первичной опухоли в сравниваемых группах больных characteristics of itga6, itgB4, and laMg2 expression in tumor cells of the primary tumor in the studied patient groups

Параметр/Parameter	Группа/Group		p
	Без лимфогенных метастазов/ Without lymph node metastases (n=81)	С лимфогенными метастазами/ With lymph node metastases (n=29)
Наличие опухолевых клеток с экспрессией ITGA6/Presence of tumor cells with ITGA6 expression
Нет/No	21 (26 %)	6 (21 %)	0,574
Есть/Yes	60 (74 %)	23 (79 %)
% ITGA6, Me [Q1; Q3]	100,0 [100,0; 100,0] (n=60)	100,0 [76,0; 100,0] (n=23)	0,577
Наличие опухолевых клеток с экспрессией ITGВ4/Presence of tumor cells expressing ITGB4
Нет/No	66 (81 %)	10 (34 %)	0,001
Есть/Yes	15 (19 %)	19 (66 %)
% ITGВ4, Me [Q1; Q3]	89,0 [34,0; 100,0] (n=15)	90,5 [55,0; 100,0] (n=19)	0,825
Наличие опухолевых клеток с экспрессией LAMG2/Presence of tumor cells with LAMG2 expression
Нет/No	75 (93 %)	4 (14 %)	0,001
Есть/Yes	6 (7 %)	25 (86 %)
% LAMG2, Me [Q1; Q3]	35,0 [23,0; 46,0] (n=6)	31,0 [12,0; 39,0] (n=25)	0,825
Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

Рис. 1. Микрофото. 1. Иммуногистохимическое исследование ткани молочной железы вне опухоли, ×400: 1А – экспрессия ITGA6 в эпителии протоков; 1Б – экспрессия ITGB4 в эпителии протоков; 1В – экспрессия LAMG2 в базальной мембране протоков.

2. Пространственный анализ: 2А – мембранная и цитоплазматическая экспрессия ITGA6 в эпителии протоков, ×854;

2Б – мембранная и цитоплазматическая экспрессия ITGB4 в эпителии протоков, ×700; 2В – экспрессия LAMG2 в базальной мембране протоков, ×883. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 1. Microphoto. 1. Immunohistochemical examination of breast tissue outside the tumor, ×400: 1A – expression of ITGA6 in the duct epithelium; 1B – expression of ITGB4 in the duct epithelium; 1C – expression of LAMG2 in the duct basement membrane.

2. Spatial analysis: 2A – membrane and cytoplasmic expression of ITGA6 in the duct epithelium, ×854; 2B – membrane and cytoplasmic expression of ITGB4 in the duct epithelium, ×700; 2C – expression of LAMG2 in the duct basement membrane, ×883.

Note: created by the authors

Рис. 2. Микрофото. 1. Иммуногистохимическое исследование ткани первичной опухоли, ×400: А – экспрессия ITGA6 в опухолевых клетках; Б – экспрессия ITGB4 в опухолевых клетках; В – экспрессия LAMG2 в опухолевых клетках. 2. Пространственный анализ: 2А – мембранная экспрессия ITGA6 в опухолевых клетках, ×844; 2Б – мембранная экспрессия ITGB4 в опухолевых клетках, ×1020; 2В – мембранная экспрессия LAMG2 в опухолевых клетках, ×878. Примечание: рисунок выполнен авторами Fig. 2. Microphoto. 1. Immunohistochemical examination of the primary tumor tissue, ×400: A – ITGA6 expression in tumor cells;

B – ITGB4 expression in tumor cells; C – LAMG2 expression in tumor cells. 2. Spatial analysis: 2A – membrane expression of ITGA6 in tumor cells, ×844; 2B – membrane expression of ITGB4 in tumor cells, ×1020; 2C – membrane expression of LAMG2 in tumor cells, ×878. Note: created by the authors

Рис. 3. Микрофото. Иммуногистохимическое исследование ткани лимфогенных метастазов, ×400: А – экспрессия ITGA6 в опухолевых клетках; Б – экспрессия ITGB4 в опухолевых клетках; В – экспрессия LAMG2 в опухолевых клетках.

Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 3. Microphoto. Immunohistochemical examination of lymph node metastases, ×400: A – ITGA6 expression in tumor cells;

B – ITGB4 expression in tumor cells; C – LAMG2 expression in tumor cells. Note: created by the authors

Таблица 3/table 3

Сравнение экспрессии itga6, itgВ4 и laMg2 в опухолевых клетках первичной опухоли и лимфогенных метастазов comparison of itga6, itgB4, and laMg2 expression in tumor cells of the primary tumor and lymph node metastases рода закономерность определялась и в отношении экспрессии LAMG2, который чаще экспрессировался в опухолевых клетках первичной опухоли в группе больных с лимфогенными метастазами (86 %), а в группе сравнения обнаруживался лишь в 7 % (χ2=65,514; р<0,001). Проводилось сравнение экспрессии ITGA6, ITGB4 и LAMG2 в ткани метастазов (рис. 3 А, Б, В) и в ткани первичной опухоли. Оказалось, что опухолевые клетки с позитивной экспрессией ITGA6, ITGВ4 и LAMG2 чаще обнаруживаются в лимфогенных метастазах. Кроме того, в метастазах регистрируется больший процент клеток с позитивной экспрессией ITGВ4, а также LAMG2 (табл. 3).

Лимфоваскулярная инвазия является одним из ключевых звеньев лимфогенного метастазирования. В настоящем исследовании случаи с наличием лимфоваскулярной инвазии чаще обнаруживались в группе с лимфогенным метастазированием (38 %) в сравнении с группой без метастазов (11 %;

р=0,001). Для изучения независимой роли экспрессии ITGA6, ITGВ4 и LAMG2 в развитии лимфогенного метастазирования оценивалась экспрессия этих маркеров с исключением случаев с лимфоваскулярной инвазией. При этом в группе больных с лимфогенными метастазами, в сравнении с группой без таковых, чаще в первичной опухоли обнаруживалась позитивная экспрессия ITGВ4 (67 и 17 %; χ2=18,409; р<0,001) и LAMG2 (78 и 4 %; χ2=50,928; р<0,001). Частота экспрессии ITGA6 в исследуемых группах не различалась (83 и 74 %; χ2=0,737; р=0,391).

Обсуждение

Результаты исследования показали, что в подавляющем большинстве случаев (97 %) в лимфогенных метастазах имеются опухолевые клетки, экспрессирующие гетеродимер альфа-6/ бета-4 и лиганд ламинин-332. При этом в лимфогенных метастазах доля опухолевых клеток,

Параметр/Parameter	Первичная опухоль/ Primary tumor (n=29)	Лимфогенный метастаз/ Lymph node metastasis (n=29)	p
Наличие опухолевых клеток с экспрессией ITGA6/Presence of tumor cells with ITGA6 expression
Нет/No	6 (21 %)	0 (0 %)	0,009
Есть/Yes	23 (79 %)	29 (100 %)
% ITGA6, Me [Q1; Q3]	100,0 [76,0; 100,0] (n=23)	100,0 [100,0; 100,0] (n=29)	1,000
Наличие опухолевых клеток с экспрессией ITGВ4/Presence of tumor cells expressing ITGB4
Нет/No	10 (34 %)	0 (0 %)	0,005
Есть/Yes	19 (66 %)	29 (100 %)
% ITGВ4, Me [Q1; Q3]	90,5 [55,0; 100,0] (n=19)	100,0 [100,0; 100,0] (n=29)	0,001
Наличие опухолевых клеток с экспрессией LAMG2/Presence of tumor cells with LAMG2 expression
Нет/No	4 (14 %)	0 (0 %)	0,038
Есть/Yes	25 (86 %)	29 (100 %)
% LAMG2, Me [Q1; Q3]	31,0 [12,0; 39,0] (n=25)	69,0 [51,5; 88,0] (n=29)	0,001

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

экспрессирующих ITGA6 и ITGВ4, составляет 100 %, а LAMG2 – 69 %. Поскольку в первичной опухоли трижды позитивные опухолевые клетки встречались в 2 раза реже, чем в метастазах, можно предполагать, что либо такие клетки обладают преимуществом при интравазации в лимфатические сосуды и поэтому чаще обнаруживаются в лимфогенных метастастазах, либо опухолевые клетки, не экспрессирующие одновременно гетеродимер и лиганд, менее жизнеспособны в лимфатическом русле. Последнее предположение имеет существенное обоснование, так как известно, что опухолевые клетки, экспрессирующие гетеродимер альфа-6/бета-4, после отрыва от базальной мембраны способны запускать синтез ламинина и взаимодействовать с ним, формируя как бы замкнутую функциональную петлю, приводящую к активации многих сигнальных путей [4]. Именно с этим процессом связывают высокую степень выживаемости и функциональную активность таких якорь-независимых клеток, что, по-видимому, име- ет место в рассматриваемых случаях. Качественная оценка экспрессии ламинина-332 в клетках первичной опухоли может быть предложена для прогнозирования вероятности поражения регионарных лимфоузлов у больных люминальным А раком молочной железы. Высокая частота экспрессии ламина-332 в опухолевых клетках лимфогенных метастазов может рассматриваться как потенциальная мишень для разработки таргетных препаратов.