Ассоциация экспрессии интегринов в ткани опухоли с гематогенным метастазированием рака молочной железы

Актуальность

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности женщин от онкологической патологии. Несмотря на то, что в последнее время увеличилось число наблюдений, когда диагностируется рак молочной железы I или II стадии, при первом обращении больных за медицинской помощью продолжают встречаться случаи диссеминированного РМЖ [1]. Отдаленные метастазы чаще всего являются причиной наступления летальных исходов при РМЖ. В связи с этим актуальным является поиск прогностических параметров, ассоциированных с гематогенным метастазированием. Изучение интегринового профиля первичной опухоли представляется важным объектом такого поиска [2, 3].

Интегрины представляют собой трансмембранные рецепторы-гликопротеины, имеющие короткий цитоплазматический С-концевой, трансмембранный и длинный внеклеточный N-концевой домены. Внеклеточные домены служат для связывания с различными лигандами. В состав интегри-нов входит две субъединицы: α и β. Субъединица α необходима для передачи сигнала на цитоскелет, благодаря чему может изменяться форма клетки. Благодаря субъединице β осуществляется взаимо- действие с внеклеточным матриксом. Различные комбинации α- и β- цепей представляют собой более 20 интегринов, связывающихся с различными лигандами, наибольшее значение среди которых придают фибронектину, ламинину, витронектину, коллагенам. Взаимодействие с указанными компонентами межклеточного матрикса обеспечивает инвазивный рост и клеточную миграцию [2]. Интегрины играют важную роль в интравазации и экстравазации – важнейших этапах гематогенного метастазирования [4]. Интегрины, которые распознают мотивы RGD, составляют наиболее важное подсемейство интегриновых рецепторов, играющих важную роль в метастазировании [5].

Благодаря межклеточным взаимодействиям и взаимодействию с межклеточным матриксом интегрины рассматривают как один из ключевых моментов опухолевой инвазии и метастазирования. CD104 (интегрин β4) является рецептором ламинина; CD51 (интегрин αV) представляет собой рецептор витронектина; CD61 (интегрин β3) является структурным компонентом мембран тромбоцитов [3]. Данные интегрины представляют интерес для изучения метастатического потенциала злокачественных новообразований с реализацией в отдаленную диссеминацию.

Таблица /table

Характеристика исследуемых групп больных

Characteristics of the groups of patients

Гематогенные метастазы/
Параметр/Parameter	Hematogenous metastases Нет/No (n=49)         Есть/Yes (n=23)	p-level

Возраст/ Age, Me [Q1; Q3]	50,0 [43,0; 60,0]	54,0 [42,0; 62,0]	0,369
Характеристика первичного опухолевого узла/Primary tumor characteristics
Т1	12/49 (24 %)	2/23 (9 %)	0,131
Т2	23/49 (47 %)	15/23 (65 %)	0,079
Т3	4/49 (8 %)	1/23 (4 %)	0,264
Т4	10/49 (21 %)	5/23 (22 %)	0,462
Степень злокачественности/Grade
G1	2/49 (4 %)	2/23 (9 %)	0,196
G2	45/49 (92 %)	20/23 (87 %)	0,252
G3	2/49 (4 %)	1/23 (4 %)	0,500
Молекулярно-генетический тип/Molecular genetic type of breast	cancer
Люминальный А/Luminal A	9/49 (19 %)	4/23 (17,5 %)	0,439
Люминальный В HER2 отрицательный/ Luminal B HER2 negative	24/49 (49 %)	11/23 (48 %)	0,468
Люминальный В HER2 положительный/ Luminal B HER2 positive	7/49 (14 %)	4/23 (17,5 %)	0,350
HER2 положительный (не люминальный)/ HER2 positive (non Luminal)	3/49 (6 %)	3/23 (13 %)	0,158
Базальноподобный (тройной негативный)/ Basal-like (triple-negative)	6/49 (12 %)	1/23 (4 %)	0,141
Критерий N/Category N
N0	21/49 (43 %)	1/23 (4 %)	0,008
N+	28/49 (57 %)	22/23 (96 %)	0,008
N1	17/49 (35 %)	12/23 (52 %)	0,875
N2	3/49 (6 %)	0/23 (0 %)	0,117
N3	8/49 (16 %)	10/23 (44 %)	0,051

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

Цель исследования ‒ изучить ассоциацию экспрессии интегринов в ткани опухоли при гематогенном метастазировании у больных раком молочной железы.

Материал и методы

Изучался биопсийный материал от 72 больных неспецифицированной инвазивной протоковой карциномой молочной железы T1–4N0–3M0–1, полученный до проведения противоопухолевой терапии. Средний возраст составил 51 ± 12 лет. Основную группу составили 23 пациентки с РМЖ с диагностированными на момент первичного обращения гематогенными метастазами, из них метастазы в кости диагностированы у 15, в печень – у 8, в легкие – у 5, в головной мозг – у 2 больных, в 6 случаях наблюдалось одновременное метастатическое поражение нескольких органов. В группу сравнения вошли 49 больных РМЖ без отдаленных метастазов (таблица). Исследовалась ткань первичной опухоли, полученная при трепанобиопсии под ультразвуковым контролем. Заключительный патоморфологический диагноз устанавливался согласно классификации ВОЗ 2019 г. [6] и классификации TNM-8 [7]. В части случаев для уточнения диссеминации выполнялась биопсия очагов из ткани легких, печени, костей под контролем УЗИ или компьютерной томографии.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартной методике. Оценивалась степень дифференцировки опухоли по Ноттингемской системе Скарфа–Блума– Ричардсона [8]. Для иммуногистохимического исследования использовались антитела Estrogen receptor (клон 1D5, Dako, Дания), Progesteron receptor (клон PgR636, Dako, Дания), c-erB-2 (Her2/ neu) (Polyclonal Rabbit, Dako, Дания), Ki67 (клон SP6, Cell Marque, США), CD61 (интегрин β3, клон JE22-64, Invitrogen, разведение 1:100, США), CD104 (интегрин β4, клон JM11-06, Invitrogen, разведение 1:200, США), CD51 (интегрин αV, поликлональные, Invitrogen, разведение 1:600, США).

На основании изучения экспрессии рецепторов к эстрогену, прогестерону, HER2, Ki67 устанавливали люминальный А, люминальный В HER2 отрицательный, люминальный В HER2 положительный,

HER2 положительный (не люминальный) и базальноподобный (тройной негативный) молекулярнобиологические подтипы рака молочной железы.

В клетках первичной опухоли оценивалось наличие или отсутствие цитоплазматической экспрессии, а также цитоплазматическая и мембранная колокализация каждого из исследуемых интегри-нов. Изолированная мембранная экспрессия исследуемых интегринов не встречалась (рис. 1).

Статистическая обработка результатов проводилась с применением пакета программ STATISTICА 10.0. Для оценки различий между группами по частоте встречаемости признака использовали сравнение долей (процентов). Поскольку нулевая гипотеза состоит в том, что частота случаев с экспрессией исследуемых субъединиц интегринов выше в группах с гематогенными метастазами, использовался односторонний критерий. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Изучались особенности экспрессии CD61, CD104 и CD51 в ткани первичной опухоли в группах с наличием и отсутствием отдаленной диссеми-нации, а также с учетом локализации отдаленных метастазов. В группе больных с гематогенными метастазами случаи с позитивной цитоплазматиче- ской экспрессией CD61 выявлялись чаще по сравнению с группой без отдаленной диссеминации (44 и 24 %; р=0,044) (рис. 2). Колокализация цитоплаз-матической/мембранной экспрессии интегрина CD61 наблюдалась на уровне тенденции чаще в группе больных РМЖ с метастазами – 9 и 2 % соответственно (р=0,085). Цитоплазматическая локализация экспрессии CD61 в группе с гематогенными метастазами обнаруживалась чаще, чем цитоплазматическая/мембранная колокализация указанного маркера (44 и 9 %, р=0,0036). Значимых различий в частоте цитоплазматической экспрессии и цитоплазматической/мембранной колокализации интегрина CD61 в случаях с различной локализацией отдаленных метастазов не обнаружено.

У больных с наличием и отсутствием отдаленных метастазов не обнаружено различий экспрессии интегрина CD104 в ткани первичной опухоли как цитоплазматической (48,0 и 43,0 % соответственно, р=0,443), так и цитоплазматической и мембранной колокализации (35,0 и 22,0 % соответственно, р=0,205). При гематогенных метастазах отсутствовали различия частоты цитоплазматической экспрессии и колокализации экспрессии в цитоплазме и мембране (48,0 и 35,0 % соответственно, р=0,275).

Рис. 1. Микрофото. Экспрессия интегринов в первичной опухоли:

A –цитоплазматическая экспрессия CD61;

B – цитоплазматическая/мембранная колокализация экспрессии CD61; C – цитоплазматическая экспрессия CD104; D – цитоплазматическая/мембранная коло-кализация экспрессии CD104; E – цитоплазматическая экспрессия CD51; F – цитоплазматическая и мембранная колокализация экспрессии CD51. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Примечание: рисунок выполнен авторами Fig. 1. Microphoto. Expression of integrins in the primary tumor: A – cytoplasmic expression of CD61; B – cytoplasmic/membrane colocalization of CD61 expression; C – cytoplasmic expression of CD104; D – cytoplasmic/ membrane colocalization of CD104 expression; E – cytoplasmic expression of CD51;

F – cytoplasmic and membrane colocalization of expression CD51. Stained with hematoxylin and eosin, ×400. Νote: created by the authors

В отличие от CD61 обращала на себя внимание ассоциация локализации отдаленных метастазов с цитоплазматической/мембранной колокализацией экспрессии CD104 в ткани первичной опухоли. Так, колокализация цитоплазматической и мембранной экспрессии CD104 чаще обнаруживалась при метастатическом поражением головного мозга по сравнению со случаями с метастазами в легких (р=0,026) или костях (р=0,036) (рис. 3).

Рис. 2. Экспрессия CD61 в ткани первичной опухоли с учетом внутриклеточной локализации и наличия гематогенного метастазирования. Примечание: рисунок выполнен авторами Fig. 2. Expression of CD61 in primary tumor taking into account intracellular localization and presence of distant metastasis. Νote: created by the authors

Частота случаев с позитивной и негативной цитоплазматической экспрессией (33,0 и 35,0 % соответственно, р=0,443), цитоплазматической/ мембранной колокализацией экспрессии CD51 (14,0 и 22,0 % соответственно, р=0,197) также не различалась у больных с наличием и отсутствием гематогенных метастазов. При метастатическом поражении отдаленных органов частота цитоплазматической экспрессии и колокализации экспрессии CD51 существенно не различалась (35,0 и 22,0 %, р=0,164). В то же время выявлена ассоциация экспрессии CD51 с локализацией отдаленных метастазов. При метастатическом поражении легких чаще обнаруживалась колокализация экспрессии CD51 по сравнению со случаями с метастазами в кости (60 и 20 % соответственно, р=0,045) (рис. 4).

Обсуждение

Обнаружены особенности внутриклеточной локализации экспрессии интегринов CD61, CD104 и CD51 в первичной опухоли у пациенток с метастатическим поражением различных отдаленных органов. В случаях с отдаленной диссеминацией чаще выявляется позитивная цитоплазматическая экспрессия интегрина CD61 по сравнению с наблюдениями без отдаленных метастазов. Имеются наблюдения, показывающие, что увеличение экспрессии интегрина β3 (CD61) в клетках 4T1 тройного негативного рака молочной железы

Рис. 3. Экспрессия интегрина CD104 в ткани первичной опухоли с учетом локализации отдаленных метастазов. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 3. Expression of CD104 in primary tumor taking into account localization of distant metastasis. Νote: created by the authors

Риc. 4. Экспрессия интегрина CD51 в ткани первичной опухоли с учетом локализации отдаленных метастазов. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 4. Expression of CD51 in primary tumor taking into account intracellular localization and presence of distant metastasis. Νote: created by the authors мыши приводит к переключению коллективного движения на движение одиночных клеток in vitro и метастазированию in vivo [9].

Интегрин αvβ3 (CD61) рассматривается как маркер стволовых клеток во многих типах солидных опухолей [10]. Более того, экспрессия αvβ3 на поверхности стволовых клеток тесно связана с фенотипом стволовых клеток, которые обладают свойствами неадгезивных опухолевых клеток и способны к якорно-независимому росту. Якорно-независимый рост рассматривают в качестве отличительной черты стволовых опухолей и прогрессирования. Установлено, что наличие αvβ3 критично при перепрограммировании опухолевых клеток на фенотип стволовых клеток опухоли в карциномах молочной железы, легких и поджелудочной железы [10, 11]. Имеются данные о том, что аберрантная экспрессия avβ3 интегрина связана с более высокой частотой метастазирования и плохим исходом многих карцином [12, 13].

Как свидетельствуют результаты проведенного исследования, локализация отдаленных метастазов может быть связана с особенностями экспрессии CD104 и CD51, причем имеет значение внутриклеточная локализация маркера в опухолевых клетках. Так, позитивная экспрессия CD104 чаще наблюдается в случаях с метастатическим поражением головного мозга независимо от внутриклеточной локализации маркера, а в случае интегрина CD51 позитивная колокализация цитоплазматической/ мембранной экспрессии наблюдалась у больных с метастазами в легких.

По данным литературы, интегрин β4 в составе гетеродимера с α6-субъединицей опосредует связывание эпителиальных клеток с базальной мембраной [12], что ассоциировано с инвазией стволовых клеток и с метастазированием рака легких в мозг [14]. Описан феномен ключевой роли экзосомаль- ных интегринов в органотропности метастазов. Показано, что экзосомальный интегрин α6β4 способен связываться с S100A4+ фибробластами и направляет метастатические клетки в легкие, в то время как интегрин αvβ5 специфически связывается с F4/80+ макрофагами и ассоциируется с метастазированием в печень [15]. Более того, имеются данные о том, что гетеродимер αvβ5 способствует связанной со стволовыми клетками инвазии и метастазированию рака легких в мозг [14].