Ассоциация полиморфизма гена ADRB2 с морфофункциональными нарушениями у больных гипертрофической кардиомиопатией

Изучена ассоциация клинической картины, структурных и функциональных особенностей миокарда левого желудочка с полиморфизмом гена ADRB2 у больных с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП). Выявлено, что комбинация генотипов Arg16rg/Gln27Gln является генотипом риска и ассоциируется с возникновением неблагоприятных клинических проявлений заболевания. Комбинация генотипов Gly16Gly/Glu27Glu является протективной и свидетельствует о благоприятном прогнозе заболевания.

The association of clinical presentation, myocardial structural and functional characteristics with ADRB2 gene polymorphism in patients with hypertrophic cardiomyopathy has been studied.The Arg16rg/Gln27Gln gene combination was found to be risk genotype and is associated with unfavorable clinical manifestations of the disease. Gly16Gly/ Glu27Glu genotype combination is protective and is indicative of a favorable prognosis of the disease

Основными факторами, определяющими течение гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП), являются мутации в генах белков саркомера [1]. В настоящее время активно ведутся поиски генетических факторов, так называемых генов-модификаторов, которые могут влиять на процесс фенотипической реализации этих мутаций [2]. Установлено, что гены-модификаторы имеют полиморфные аллели (вариации последовательности ДНК), которые кодируют белки с различной функциональной активностью. Идентифицирован ряд генов, претендующих на эту роль. Подтверждено влияние генов ренин-ангиотензин-альдо-стероновой системы (РААС): ангиотензиногена, ангиотензин-превращающего фермента, рецептора ангиотензина II типа 1 и синтетазы альдостерона на развитие гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ). Большое значение в формирование фенотипических проявлений ГКМП имеет также высокая активность симпатического отдела вегетативной нервной системы (СОВНС). Его активация ведет к развитию ГЛЖ как непосредственно за счет активации рецепторов СОВНС, так и опосредованно за счет активации РААС. Поэтому гены, кодирующие элементы СОВНС, в первую очередь гены адренорецепторов, являются одними из основных генов-модификаторов, которые могут влиять на клиническую картину ГКМП [3].

В настоящее время большое внимание уделяется изучению полиморфизма гена ADRB2, который находится в области 5д31-32 5-й хромосомы. В сердце (32-АР представлены как в желудочках, так и в предсердиях. В значительном количестве эти рецепторы экспрессируются на мембранах пейсмекерных клеток, что указывает на их важную роль в регуляции ритма сердца. В кодирующей части гена ADRB2 выявлено 12 полиморфизмов, 5 из которых приводят к замене аминокислоты: Arg16Gly, Gln27Glu, Val34Met, Thr164lle и Ser220Cys. Все эти маркеры связывают с функциональными свойствами рецептора. В исследовании [4,5] показано влияние полиморфизмов Arg16Gly и Gln27Glu не только на уровень артериального давления, но и развитие гипертрофии ЛЖ.

Целью настоящего исследования был анализ ассоциации клинической картины и функциональных нарушений с полиморфизмом гена

ADRB2 у пациентов, страдающих ГКМП.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 89 пациентов с ГКМП (69 мужчин и 20 женщин, средний возраст 4б,7±15,7 года), среди них у 56 диагностирована обструктивная форма, у 33 пациентов - необструктивная форма заболевания. Семейная форма заболевания выявлена у 26 пробандов, отягощенный анамнез имели 44,3% больных с ГКМП (28,9% сочетание ГКМП и АГ, 15,4% сочетании ГКМП и ИБС). В контрольную группу вошли 104 здоровых донора, сопоставимых по возрасту и полу с больными ГКМП.

Оценивали клиническую картину заболевания, в частности такие параметры, как функциональные классы (ФК) сердечной недостаточности (СН), систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) артериальное давление. Определяли следующие эхокардиографические (ЭхоКГ) параметры: толщину миокарда межжелудочковой перегородки (ТМЖП) и задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ), конечный систолический и диастоличе-ски размеры (КСР и КДР) левого желудочка (ЛЖ), размер левого предсердия (ЛП), наличие обструкции выносящего тракта ЛЖ (ВТЛЖ), индекс массы миокарда (ИММ).

По данным суточного мониторирования ЭКГ анализировались следующие показатели: средняя ЧСС, уд/мин, общее количество желудочковой и суправентрикулярной эктопической активности за сутки, наличие сложных нарушений ритма. Оценивали показатели, характеризующие ишемию миокарда: количество эпизодов ишемии, суммарную длительность ишемии в течение суток, глубину депрессии сегмента ST.

У всех пациентов проводили анализ полиморфизма гена ADRB2. Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли методом Mathew [6]. Полиморфизмы A46G (Arg16Gly) и C79G (Gln27Glu) в гене ADRB2 изучали с использованием метода ПЦР-ПДРФ анализа. Последовательности использованных в работе праймеров и условия ПЦР представлены в таблице 1 [7]. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе MyCyclerTM Termal cycler (BIORAD).

Таблица 1. Последовательность праймеров и программа проведения ПЦРГен Последовательность праймера Программа проведения ПЦР Размер продукта

ADRB2 F: 5'gaacggcagcgccttcttgctggcaccccat3'       940С-2мин, [940С-30с,          242 п.н.

640С-45С, 720С-1мин] х35

R: 5'ctgccaggcccatgaccagatcag3'                иклов, 720С-7мин

Таблица 1. Распределение частот встречаемости различных генотипов

(32-адренорецептора у больных ГКМП

Генотипы 16(Arg> Gly) 27(Gln>Glu)	Количество больных ГКМП
	n	%
Arg 16Arg	21	23,3
Arg16Gly	44	48,9
Gly16Gly	25	27,8
Аллель Arg 16	86	47,8
Аллель Gly16	94	52,2
Gln27Gln	32	35,5
Gln27Glu	46	51,1
Glu27Glu	12	13,3
Аллель Gln27	110	61,1
Аллель Glu27	70	39,9

Амплифицированный фрагмент длиной 242 п.н. подвергали рестриктному расщеплению эндонуклеазами Есо130I (Fermentas) и Satl (Fermentas) для выявления точечных нуклеотидных замен A46G и C79G, соответственно. Продукты амплификации фракционировали в 2,5% агарозном геле с бромистым этидием и визуали-ровали в УФ-свете (рис. 1).

Статистическая обработка материала проводилась с использованием программного пакета «Statistica for Windows 6.0» и «SPSS Statistics 17». Об ассоциации генотипов с возникновением клинических проявлений ГКМП судили по величине отношения шансов (OR), которую рассчитывали по стандартной формуле OR=(A/B)/(C/D), где А и В - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и С и D - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. OR указан с 95%-ным доверительным интервалом (95% CI) [8]. Для сравнения значений клинических показателей между группами пациентов с различными генотипами использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

На первом этапе работы была проанализирована частота встречаемости различных генотипов Arg16Gly и Gln27Glu (32-АР у обследованных нами пациентов с ГКМП. Распределение частот встречаемости различных генотипов (32-АР представлено в таблице 1.

В литературе описано неравновестное сцепление между 16 и 27 кодонами [9], т.е. неслучайное распределение частот аллелей по этим сайтам, которое может быть обусловлено не только тесным генетическим сцеплением генов, но и наличием адаптивного преимущества конкретной комбинации аллелей. Носители гомозиготного генотипа Glu27Glu практически всегда имеют гомозиготный генотип Gly16Gly, гаплотип Arg16Glu27 встречается чрезвычайно редко (менее 1% в популяции). В нашем исследовании все индивидуумы, гомозиготные по Glu27Glu, были гомозиготны по Gly16Gly (рис. 1), комбинации генотипов Arg16Gly/Glu27Glu и Arg16Arg/Glu27Glu отсутствовали.

GG GG AG АА AG АА М

GC GC М GG СС GG

А)                                                            Б)

Рисунок 1. Электрофореграмма фрагментов рестрикции гена (32-АР

• А) электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой EcoBOI (Styl);

Б) электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой Satl (Епи4Н1).

Таблица 3. Клинические и эхокардиографические показатели у больных ГКМП с различными генотипами 02-АР

Показатели	Генотип Arg16Gly			Генотип Gln27Glu
	Arg/Arg	Arg/Gly	Gly/Gly	Gln/GIn	Gln/Glu	Glu/Glu
ФК сн, п (%) I II III	9 (26,0%) 12(31,0%)	8 (67,0%) 16(47,0%) 16(41,0%)	4 (33,0%) 9 (26,0%) 11 (28,0%)	2 (17,0%) 13(38,0%) 15 (38,0%)	7 (58,0%) 18(53,0%) 19(49,0%)	3 (25,0%) 3 (9,0%) 5 (13,0%)
ЧСС, уд/мин	68,0±4,42	70,2±2,88	69,6±2,38	67,1 ±3,02	72,2±2,85	65,8±2,66
САД, мм рт. ст.	134,3±3,8	131,3±2,9	130,6±3,35	133,0±3,06	130,3±2,54	134,5±6,89
ДАД, мм рт.ст.	85,5±2,56	81,9±1,65	83,0± 1,91	83,9± 1,91	82,4±1,57	83,6±3,57
ЛП, см	44,5± 1,55	44,1 ±0,97	43,7±1,21	44,2±1,21	44,3±0,91	43,3±2,04
ТМЖП, см	19,3±0,80	20,1 ±0,65	18,7±0,80	19,1 ±0,63	19,9±0,68	19,3±0,87
КДР, см	51,4±2,22	50,3±0,90	50,9±1,00	50,9±1,70	51,0±0,81	49,1 ±1,75
КСР, см	32,4±2,12	31,0±1,09	30,8±1,14	31,9±1,64	31,1 ±0,98	30,9±2,30
ФВ, %	61,4±1,91	5 9,8± 1,49	64,1 ±2,03	62,5±1,71	60,3± 1,44	62,1 ±2,98
ИММ, г/м2	182±13,2	174,9±8,8	173,0±10,8	171,0±9,96	186,5±8,74	148±11,4*
ГДВТЛЖ >30	63,5±4,53	61,9±4,48	73,2±7,00	64,87±4,05	65,6±4,78	61,3±11,39
ГДВТЛЖ <30	15,0±2,58	9,7±1,56	10,2±1,82	13,6±2,10	10,0±1,50	9,12±2,51
Е/А	1,25±0,13	1,35±0,10	1,45±0,22	1,28±0,12	1,27±0,09	1,86±0,39
ВИР, мс	118,1 ±6,7	118,1 ±8,2	115,3±10,2	115,33±5,9	121,53±8,9	107,18±6
DT, мс	192±14,5	165,5±6,6	186,2±20,4	190,7±11,6	170,6±11,2	171,3±16,5

* - значимые различия по критерию t-Стьюдента, р<0,05

Анализ связи клинической картины, гемодинамических и эхокардиографических показателей с генетическим полиморфизмом 02-АР в 16 и 27 кодонах представлен в таблице 3. Было выявлено, что средние уровни таких показателей, как ЧСС, САД, ДАД, а также величина ЛП, ТМЖП, КДР, КСР, ФВ и ГДВТЛЖ не зависят от генотипа 02-АР в исследуемых кодонах. Достоверные различия наблюдались лишь в отношении показателя ИММ:

у носителей генотипа Glu27Glu среднее значение этого показателя (148,1±11,39 г/м2) было ниже, чем у индивидуумов с другими вариантами генотипов, при этом различия с носителями генотипа Gln27Glu были достоверными (t =2,67, р<0,05). У больных, имеющих комбинацию генотипов Arg16Arg/Gln27Gln, величина ИММ составила 182,0±13,2 г/м2, тогда как у пациентов с комбинацией генотипов Gly16Gly/Glu27Glu значение это-

Рис. 1. Распределение частот встречаемости различных комбинаций генотипов 16(Arg>Gly) и 27(Gln>Glu) гена 02-АР у больных ГКМП

Таблица 4. Незначимые нарушения ритма сердца поданным суточного мониторирования у больных ГКМП с различными генотипами 02-АР

Показатель	Генотип Arg16Gly			Генотип Gln27Glu
	Arg/Arg	Arg/Gly	Gly/Gly	Gln/GIn	Gln/Glu	С1и/С1и
ЖЭ	64,9±21,0* (17 чел.)	2б,8±7,б (35 чел.)	29,6±12,1 (23 чел.)	53,0±15,0* (11 чел.)	32,3±9,4** (39 чел.)	12,3±3,31 (25 чел.)
нэ	41,1±13,4 (19 чел.)	33,1 ±6,9 (37 чел.)	39,4±10,8 (19 чел.)	34,4±9,34 (28 чел.)	33,5±7,0 (37 чел.)	55,2±18,2 (10 чел.)

* - значимые различия по критерию t-Стьюдента, р<0,05

го параметра было 148,1 ± 11,39 г/м2.

Выявлено, что у больных с I ФК СН не встречался генотип Arg16Arg, а генотип Gln27Gln встречался реже, чем у пациентов из II и III ФК СН.

У 12,4% пациентов с ГКМП по данным суточного мониторирования ЭКГ были выявлены жизнеугрожающие нарушения ритма: пароксизмы неустойчивой желудочковой тахикардии (ЖТ), частая желудочковая одиночная и групповая экстрасистолия (ЖЭ), сочетание желудочковой и суправентрикулярной эктопической активности. У 87,6 % при суточном мониторировании ЭКГ регистрировалась непатологическая желудочковая и суправентрикулярная активность. На основании клинической значимости этих результатов нами были выделены две группы больных ГКМП с различными типами аритмий: 1 группа - клинически значимые аритмии (групповая или одиночная ЖЭ более 300 экстрасистол в сутки, пароксизмальные желудочковые и суправентрикулярные нарушения ритма), 2 группа - незначимые желудочковые и суправентрикулярные аритмии (одиночные экстрасистолы до 300 в сутки), не имеющие клинического значения и не влияющие на прогноз. В этих группах определяли влияние генотипов в 16 и 27 кодонах на значимость нарушений ритма сердца (таблица 4,5).

Анализ генетического полиморфизма в 27 кодоне показал, что в группе больных с незначимыми аритмиями у носителей генотипа Gln27Gln наблюдалось наибольшее среднее значение ЖЭ, у носителей GIh27GIh - наименьшее, а у гетерозиготных носителей Gln27Glu - промежуточное (таблица 4). При исследовании генетического полиморфизма в 1 б кодоне было показано, что у носителей генотипа Arg16Arg среднее значение ЖЭ было выше в 2,2-2,4 раза, чем у больных с другими вариантами генотипов, при этом различия с носителями генотипа Arg16Gly были достоверными.

У пациентов со значимыми аритмиями (таблица 5), которые ассоциируются с риском внезапной смерти у данной категории больных, не встречался генотип GIh27GIh, а генотип Gly16Gly был выявлен только у одного пациента.

В отношении показателей ишемии миокарда по данным суточного мониторирования ЭКГ (таблица 6) выявлено достоверное повышение продолжительности депрессии сегмента ST у пациентов с генотипами Arg16Arg по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа Arg16Gly.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ген 02-АР характеризуется выраженным природным полиморфизмом, обусловленным различиями в последовательности нуклеотидов. Полученные результаты по изучению влияния генетического полиморфизма 02-АР на клинические и морфофункциональные параметры сердца у больных ГКМП указывают на наличие связи по-

Таблица 5. Значимые нарушения ритма сердца по данным суточного мониторирования у больных ГКМП с различными генотипами 02-АР

Показатель	Генотип Arg16Gly			Генотип Gln27Glu
	Arg/Arg	Arg/Gly	Gly/Gly	Gln/GIn	Gln/Glu	С1и/С1и
ЖЭ	2691,0±1649,1 (4 чел.)	2025,8±820,3 (6 чел.)	9090,0±9090 (1 чел.)	2388,6±1312,7 (5 чел.)	3344,3 ±1401,7 (6 чел.)	-
НЭ	2000,0±1697,0 (2 чел.)	538,0±±98,5 (3 чел.)	901,0±901,0(1 чел.)	2000,0±1697,0 (2 чел.)	628,0± 114,39 (4 чел.)	-

Таблица 6. Показатели ишемии миокарда по данным суточного мониторирования у больных ГКМП с различными генотипами Arg16Gly гена 02-АР

Показатель	Генотип Arg16Gly			Генотип Gln27Glu
	Arg/Arg	Arg/Gly	Gly/Gly	Gln/GIn	Gln/Glu	С1и/С1и
Количество эпизодов ишемии	3,б±0,50	3,2±0,48	4,1 ±1,10	3,8±0,54	3,5±0,41	2,7±0,70
Продолжительность эпизодов ишемии, мин	95,5±13,0*	60,5 ±10,2	89,3±19,3	80,7±10,9	77,0±12,9	64,3± 17,3

*- значимые различия по критерию t-Стьюдента, р<0,05

лиморфных вариантов в 1 б и 27 кодонах с такими показателями, как ФК СН по классификации NYHA, ИММ, нарушения ритма и степень выраженности ишемии миокарда при суточном мониторировании ЭКГ. Анализ комбинаций аллельных вариантов полиморфизмов генов ADRB2 показал, что комбинация генотипов Gly16Gly/Glu27Glu ассоциирована с более благоприятной клинической картиной заболевания и степенью выраженности ГЛЖ, тогда как комбинация Arg16Arg/Gln27Gln связана с более тяжелой клинической картиной, более выраженным ремоделированием ЛЖ и наличием значимых нарушений ритма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что генотип Arg16Arg/Gln27Gln является генотипом «риска» и ассоциируется с возникновением неблагоприятных клинических проявлений заболевания. Комбинация генотипов Gly16Gly/Glu27Glu является протективной и свидетельствует о благоприятном прогнозе заболевания.

Поскольку известно [9], что полиморфные варианты генов 0-АР связаны не только с фенотипическими особенностями заболевания, но и с эффективностью лечения 0-адреноблокаторами, то очень важно провести исследование ассоциации генетического полиморфизма 0-АР с чувствительностью пациентов к лекарственным препаратам, что позволит оптимизировать лечение 0-адреноблокаторами у пациентов с ГКМП.