Ассоциация полиморфизмов Ser447Ter гена LPL и rs9939609 гена FTO с ожирением у детей и подростков в популяции Ростова-на-Дону

2017]. Ожирение является серьезной медицинской и экономической проблемой, поскольку повышает риск развития гипертонии, сахарного диабета и ряда других заболеваний [Velazquez, Apovian, 2018]. В настоящее время установлено, что причинами ожирения, кроме нарушения пищевого поведения и малоподвижного образа жизни, является и генетическая предрасположенность [Goodarzi, 2018]. При этом наиболее распространенными являются полигенные варианты ожирения.

В настоящее время установлен ряд полиморфизмов генов, связанных с риском ожирения. Среди них наиболее исследованы полиморфизмы гена FTO , который расположен в хромосоме 16 (16q12.2); его мРНК экспрессируется в основном в гипоталамусе. Ген FTO участвует в регуляции пищевого поведения посредством его влияния на нейромодуляторные системы. Несмотря на то, что выявлена связь между однонуклеотидными полиморфизмами FTO (SNP) и ожирением, однако полиморфные участки этого гена различаются в разных популяциях [Ehrlich, Friedenberg, 2016]. В том числе, среди значительных генетических факторов риска ожирения называют носительство полиморфизма rs9939609 гена FTO : аллель А и генотип АА связывают с избыточной массой тела [Al-Serri et al., 2018; Mozafarizadeh et al., 2019; Priliani et al., 2020].

Другим геном, определяющим повышенный риск ожирения, является ген липопротеинлипазы ( LPL ), играющий ключевую роль в метаболизме липопротеинов [Eshghinia et al., 2014; Baturin et al., 2016]. Ли-попротеинлипаза гидролизует триглицериды в липопротеинах на две жирные кислоты и одну молекулу моноацилглицерина [Mead et al., 2002]. Ген LPL расположен в хромосоме 8p22, кодирует белок 448 аминокислот. Установлены высокая степень вариабельности последовательности гена LPL , неравновесие связей по сцеплению разных полиморфизмов гена LPL ( Ser447Ter (5447X) и HindIH) [Humphries et al., 1998]. В различных популяциях исследуется связь полиморфизмов гена LPL с заболеваниями, связанными с дислипопротеинемией. В том числе показано, что полиморфизм Ser447(Ter) гена LPL , вызванный трансверсией цитозина на гуанин (C1791G), влияет на захват клеточными рецепторами липопротеинов [Stocks et al., 1992]; генотип rs238-GG-GC значительно связан с повышением уровня триглицеридов по сравнению с генотипом CC [Emamian et al., 2015].

В данном исследовании изучали связь между полиморфизмами LPL Ser447 -Ter и FTO rs9939609 при ожирении в детской и подростковой популяции г. Ростова-на-Дону.

Материалы и методы

В исследовании «случай-контроль» изучена взаимосвязь полиморфизмов rs9939609 гена FTO и Ser447Ter (S447X) гена LPL с ожирением у детей и подростков, проживающих в г. Ростове-на-Дону. Обследование проводили в Медицинском центре «Наука» (г. Ростов-на-Дону, Россия); изучение генотипов осуществляли на кафедре генетики Южного федерального университета.

В соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этическими принципами научных медицинских исследований с участием человека» (с поправками 2000 г.), а также «Правилами клинической практики в Российской Федерации», все исследования проводились с информированного согласия опрошенных волонтеров (утверждено приказом Минздрава России от 19 июня 2003 г. № 266).

В обследовании приняли участие 520 детей и подростков обоего пола в возрасте от 3 до 18 лет. Основную группу составили 370 детей и подростков с ожирением, а контрольную ‒ 150 детей и подростков без ожирения. Индекс массы тела (ИМТ) использовался в качестве основного критерия отбора добровольцев для исследования: дети и подростки с ИМТ>30 составили группу с ожирением (основная группа), контрольную группу составили дети и подростки без ожирения (ИМТ˂20). Группы были сопоставимы по возрасту, полу и этнической принадлежности.

Молекулярно-генетические исследования проводили методом аллель-специфичной ПЦР. Для анализа использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови. Аллельные варианты гена FTO ( rs99305069 ) и гена LPL ( Ser447Ter ) изучали с помощью набора реагентов SNP-Express (Литех, Россия). Анализ основан на реакциях амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Продукты амплификации разделяли горизонтальным электрофорезом в 3%-ном агарозном геле. Чистоту образцов ДНК проверяли на спектрофотометре NanoDrop 2000c (Termo Scientific, USA).

Для оценки ген-генных взаимоотношений использовали метод снижения размерности – MDR (Multifactor Dimensionality Reduction). Мультило-кусные генотипы были объединены в группы высокого и низкого риска для сведения предикторов генотипа к одному измерению. После получения набора моделей для определения наилучшей общей из них использовали индексы сбалансированной точности тестирования (TBA) и согласованности перекрестной валидации (CVC). Коррекцию на множественные сравнения проводили с использованием пермутационного теста. Статистически значимыми считали модели с уровнем значимости p ˂ 0.05 [Hahn et al., 2003]. Оценку характера и силы межгенных взаимоотношений и их визуализацию проводили с помощью метода MDR.

Соответствие эмпирического распределения генотипов и аллельных вариантов/генотипов генов

LPL и FTO теоретически ожидаемому распределению при равновесии Харди-Вайнберга анализировали с использованием χ2 теста. Была проведена коррекция для непрерывности и расчета соотношения шансов и 95% доверительного интервала (95% CI). Для определения риска ожирения, связанного с аллелями риска, проводили расчет связи между генотипом и аллелем ожирения с использованием отношения шансов (OR) и 95% доверительного интервала (CI), где непараметрические данные выражали с помощью компьютерной программы WinPepi версии 11.655 с использованием χ2 теста и критерия Фишера. Значимые вариации частоты генотипов и аллелей рассчитывали с помощью метода Харди-Вайнберга.

Результаты исследования

Известно, что совместное присутствие нескольких аллельных вариантов генов, кодирующих функционально связанные белковые молекулы, может привести к формированию нового фенотипа вследствие незначительных, но взаимосвязанных изменений в функционировании генома и протео-ма. В ходе проведения анализа методом MDR выявлена модель межгенных взаимодействий, которая демонстрирует связь этих взаимоотношений полиморфизмов rs9939609 гена FTO и Ser447ter гена LPL с развитием ожирения (р = 0.0013). Точность предсказания модели (TBA) составила 57%, показатель согласованности модели (CVC) 10/10 (воспроизводимость 100%). При взаимодействии генов, входящих в данную модель, риск развития ожирения повышен (OR=1.903; 95% CI (1.282– 2.825)).

При анализе взаимодействия полиморфных локусов гена FTO и гена LPL, ассоциированных с ожирением, установлены комбинации пяти сочетанных генотипов повышенного риска и двух - пониженного риска ожирения (рис. 1). У детей и подростков рисковыми являются сочетания генотипов ТТ, АТ (rs9939609, FTO) и СС, CG (Ser447Ter, LPL), а также AA (rs9939609, FTO) и GG (Ser447Ter, LPL).

При анализе взаимодействия полиморфных ло- кусов гена FTO и гена LPL, ассоциированных с ожирением, установлены комбинации пяти сочетанных генотипов повышенного риска и двух – пониженного риска ожирения (рис. 1). У детей и подростков рисковыми являются сочетания генотипов ТТ, АТ (rs9939609, FTO) и СС, CG (Ser447Ter, LPL), а также AA (rs9939609, FTO) и GG (Ser447Ter, LPL).

На рисунке 2 представлен граф, иллюстрирующий характер и силу межгенных взаимоотношений полиморфных вариантов Ser447Ter C>G гена LPL и re9939609 T>A гена FTO у детей и подростков с ожирением. Интересно, что характер взаимодействия FTO re9939609 T>A и LPL Ser447Ter C>G – выраженный антагонистичный (цвет линии синий).

LPLSer447Ter

Рис. 1. Распределение частот двухлокусных генотипов генов FTO re9939609 T>A и LPL Ser447Ter C>G среди детей и подростков обеих групп с ожирением.

Темно-серые ячейки – генотипы повышенного риска, светло-серые – пониженного риска, белые – сочетание комбинаций генотипов отсутствуют, левые столбики в ячейках – число обследованных с ожирением, правые – число обследованных контрольной группы; 0 – гомозиготы по первому аллелю, 1 – гетерозиготы, 2 – гомозиготы по второму аллелю

Рис. 2 . Граф межгенных взаимодействий FTO re9939609 T>A и LPL Ser447Ter C>G при развитии ожирения у детей и подростков.

Информационная ценность маркеров представлена на вершинах, а информационная ценность взаимодействия для пары локусов – на линии, где сила и направленность взаимодействия выражены в процентах энтропии

Далее проведен анализ распределения частот генотипов LPL Ser447Ter и FTO rs9939609 у детей и подростков контрольной группы и страдающих ожирением. Частота генотипа ТТ в группе с ожирением была выше (22.4%), чем в контрольной группе (17.3%). Тем не менее, значимая взаимо- связь была установлена между полиморфизмом rs9939609 гена FTO и выявленными группами риска ожирения (χ2 = 9.965, P = 0.0079).

При анализе распределения частоты генотипов полиморфного локуса Ser447Тer гена LPL показано, что генотип CC был у 313 детей и подростков с ожирением (84.6%), у 15.1% ‒ генотип CG , у 0.3% ‒ GG генотип. В контрольной группе частота встречаемости генотипа СС составила 83%, генотипа CG – 16.7%, генотип GG в этой группе не встречался. Связи полиморфного локуса Ser447Тer гена LPL с ожирением не было установлено (χ² = 0.586; р > 0.05).

Таблица 1

Распределение частот полиморфизмов Ser447Ter гена LPL и rs9939609 гена FTO в рамках доминантной и рецессивной моделей

Генотипы	n = 370(%)	n = 150(%)	χ2	p	ОШ (95% ДИ)
FTO TT	83 (22.4)	26 (17.3)	9.965	0.0079
AT	182 (49.2)	60 (40)
AA	105 (28.4)	64 (42.7)
*AA + AT vs TT	287 (77.6) 83 (22.4)	124 (82.7) 26 (17.3)	1.675	0.234	0.73 (0.45 – 1.18)
**AA vs AT + TT	105 (28.4) 265 (71.6)	64 (42.7) 86 (57.3)	9.933	0.002	0.53 (0.36 – 0.79)
LPL Ser447Ter CC	313 (84.6)	125 (83.3)	0.586	0.779
CG	56 (15.1)	25 (16.7)
GG	1 (0.3)	0 (0)
*GG + CG vs CC	57 (15.4) 313 (84.6)	25 (16.7) 125 (83.3)	0.128	0.791	0.91 (0.55 – 1.52)
**GG vs CG + CC	1 (0.3) 369 (99.7)	0 (0) 150 (100)	0.406	1.000	1.22 (0.05 – 29.89)

X ² – Хи-квадрат Пирсона, ОШ – отношение шансов, 95%-ный доверительный интервал – ДИ, *доминантная модель, **рецессивная модель.

При сопоставлении результатов сопряженности между полиморфными участками гена LPL и наличием ожирения выявлен лишь один случай с мутантным генотипом GG в группе с ожирением. Гетерозиготный генотип был представлен как в группе с ожирением (15.1%), так и в контрольной группе (16.7%). Частота встречаемости полиморфизма Ser447Ter гена LPL в этих группах статистически не различалась, поэтому данный полиморфный локус без межгенных взаимодействий с другими генетическими предикторами ожирения в данной популяции детей и подростков не ассоциирован с ожирением.

Для выявления соответствия распределению Харди-Вайнберга было проанализировано частотное распределение генотипов гена FTO . При расчете относительного риска ожирения по отношению шансов (OR) истинный генетический эффект не соответствовал распределению Харди-Вайнберга, поэтому является неэффективным для исследуемых групп. Частота генотипа АА была достоверно повышена в контрольной группе относи-

При анализе данных рецессивной модели « АА vs AT + ТТ » были получены результаты, согласно которым гипотеза рецессивности дикого аллеля подтверждается (Р = 0.002; ОR 0.53 95% CI (0.360.79). Интересно, что 28.4% детей и подростков с ожирением и 42.7% обследованных контрольной группы были с генотипом АА . Наибольший процент детей и подростков с ожирением имели генотип АТ , генотип ТТ был примерно одинаково представлен в группе с ожирением и среди детей и подростков контрольной группы (18% и 17.3%, соответственно) (табл. 1).

тельно группы с ожирением ( X² = 9.933, Р = 0.002). При этом частота генотипов ТТ (Р = 0.23; ОR 1.38 95% CI (0.85–2.24)) и АТ (Р = 0.06; ОR 1.45 95% CI (0.99–2.13)) достоверно не отличалась у детей и подростков с ожирением и не страдающих ожирением обследованных добровольцев (табл. 2).

При исследовании гена LPL Ser447Ter , показано, что распределение генотипов в исследуемом локусе соответствует равновесию Харди–Вайнберга в обеих группах (с ожирением и в контрольной группе) (табл. 2). Частоты генотипов CC (p= 0.79; OR 1.10 95% CI (0.66-1.83)) и CG (p = 0.69; OR 0.89 95% CI (0.53-1.49)) достоверно не различались в обеих группах.

Согласно анализа распределения частот аллелей гена FTO в контрольной группе частота встречаемости аллеля Т составила 37.3%, аллеля А – 62.7%, тогда как в группе с ожирением распределение частот этих аллелей не столь сильно различалось: частота их встречаемости составила, соответственно, 47 и 53%. В результате разница между контрольной группой и группами детей и подрост- ков с ожирением по показателю распределения данных частот была достоверной (р = 0.005).

Таблица 2

Анализ распределения частот генотипов LPL (Ser447Ter) и FTO (rs9939609) у обследованных детей и подростков

Генотипы	Группа с ожирением	Контрольная группа	X2	ОШ (95% ДИ)	p
rs9939609
TT	83	26	1.675	1.38 (0.85 – 2.24)	0.234
AT	182	60	3.622	1.45 (0.99 – 2.13)	0.065
AA	105	64	9.933	0.53 (0.36 – 0.79)	0.002
Total	370	150
P -HWE	0.806	0.075

Ser447Ter

CC	313	125	0.128	1.10 (0.66 – 1.83)	0.791
CG	56	25	0.190	0.89 (0.53 – 1.49)	0.689
GG	1	0	0.557	1.68 (0.07 – 40.99)	1.000
Total	370	150
P -HWE	0.359	0.265

X ² - Хи-квадрат Пирсона, ОШ - отношение шансов, 95%-ный доверительный интервал - ДИ, р - уровень значимости, P-HWE - вероятность равновесия Харди-Вайнберга.

При сравнении распределения аллелей гена группе – 8.3%. При этом достоверных различий LPL установлено, что в обеих группах частота ал- распределения аллелей гена LPL в этих группах не леля C была выше 90%, а частота аллеля G в груп- установлено (р = 0.80) (табл. 3).

пе с ожирением составила 7.8%, в контрольной

Таблица 3

Распределение частот аллелей полиморфизмов генов LPL (Ser 447Ter) и FTO ( rs9939609) у обследованных детей и подростков

Частота аллелей	Группа с ожирением	Контрольная группа	χ2	p	ОШ (95% ДИ)
	n = 740 %	n = 300 %
FTO/ T	348 (47.0)	112 (37.3)	8.132	0.005	1.49	1.13 – 1.96
FTO/ A	392 (53.0)	188 (62.7)			0.67	0.51 – 0.88
LPL/ C	682 (92.2)	275 (91.7)	0.071	0.801	1.07	0.66 – 1.74
LPL/ G	58 (7.8)	25 (8.3)			0.94	0.57 – 1.53

X ² – Хи-квадрат Пирсона, ОШ – отношение шансов, 95%-ный доверительный интервал – ДИ, р – уровень значимости.

Обсуждение результатов

Детское ожирение остается одной из наиболее важных проблем в области здравоохранения, поскольку имеет как краткосрочные, так и долгосрочные последствия [Di Cesare et al., 2019]. У детей с ожирением повышен риск развития эмоциональных и поведенческих расстройств, а также ряда соматических заболеваний [Friedemann et al., 2012; Brady, 2017; Quek et al., 2017]. В долгосрочной перспективе ожирение у детей повышает риск развития кардиометаболических нарушений у взрослых [Park et al., 2012]. Это актуализирует важность определения причин детского ожирения и его профилактику. Развитие персонализированной геномики позволит идентифицировать генетические факторы риска заболеваний, в частности, ожирения. Детский фенотип ожирения более удо- бен для анализа, поскольку меньше связан с образом жизни и больше с полиморфизмом генов по сравнению со взрослыми [Li et al., 2020], что доказывают и результаты исследования, согласно которым индекс массы тела у детей более тесно коррелирует с материнским, чем отцовским ИМТ, и что значения ИМТ генетически детерминированы на 40‒90% ИМТ [Fawcett, Barroso, 2010].

Данное исследование представляет собой первое сообщение о частоте полиморфизмов Ser447Ter гена липопротеинлипазы и rs9939609 гена FTO при ожирении в детской и подростковой популяции г. Ростова-на-Дону. Ген FTO является генетическим фактором риска ожирения, особенно полиморфизм первого интрона данного гена ( rs9939609 ). Для анализа также был выбран полиморфизм Ser447Ter гена липопро-теинлипазы, поскольку предполагают, что при ожирении растет активность ЛПЛ в жировой ткани [Kern et al., 1990].

В проведенном исследовании с использованием метода снижения размерности MDR была выявлена модель межгенных взаимодействий полиморфизмов rs9939609 гена FTO и Ser447ter гена LPL с развитием ожирения. В результате определены сочетания генотипов повышенного и пониженного риска ожирения в детской и подростковой популяции г. Ростова-на-Дону. Установлен антагонистичный характер взаимоотношений полиморфных вариантов Ser447Ter C>G гена LPL и re9939609 T>A гена FTO у детей и подростков с ожирением. Этот факт может свидетельствовать о том, что полиморфизм LPL и re9939609 T>A при взаимодействии с геном FTO ( re9939609 ) снижает атерогенное действие мутантного гена FTO . Это подтверждают данные литературы, согласно которым данный вариант гена LPL определяет синтез укороченной липопротеиназы, тем самым повышая сродство липопротеинов к рецепторам клетки и снижая уровень проатерогенных факторов [Wang et al., 2011].

В проведенном исследовании также было установлено, что распределение аллеля А гена FTO в обеих группах соответствовало данным о его встречаемости в разных популяциях [Luczynski et al., 2012; Moleres et al., 2012]. В литературе сообщается о том, что носительство генотипов TA и AA гена FTO и, соответственно, аллеля A определяет риск ожирения, в том числе, в детской популяции [Liu et al., 2017; Wang et al., 2020; Abd Ali et al., 2020]. Однако большинство работ в рамках проблемы ассоциации полиморфизмов генов с ожирением в настоящее время выполнено на взрослой популяции [Prakash et al., 2016; Lubis et al., 2017 и др.]. В данном исследовании не обнаружили преобладания носителей полиморфизма rs9939609 гена FTO среди детей и подростков с ожирением относительно контрольной группы: при расчете относительного риска ожирения по отношению шансов (OR) эффект аллеля А не соответствовал ожиданию. Предположительно это связано с гендерными различиями ассоциации полиморфизма rs9939609 гена FTO с признаками ожирения: чувствительностью к инсулину и уровнем глюкозы в плазме крови [Jacobsson et al., 2008], а также с различием физической активности и потребления пищи у носителей полиморфизма rs9939609 как в контрольной, так и основной группах [Wiemerslage et al., 2016]. Гендерные и поведенческие факторы в данном исследовании не учитывали.

Таким образом, поскольку основное количество исследований по проблеме ассоциации полиморфизмов генов, связанных с ожирением, в частности, полиморфизма rs9939609 гена FTO, было проведено на взрослой популяции, можно предположить, что существуют возрастные различия в значимости полиморфизмов генов, связанных с ожирением, на риск ожирения. Это определяет важность поиска новых генетических факторов риска ожирения в детской и подростковой популяции, которые в долгосрочной перспективе могут определить развитие ожирения и связанных с ним заболеваний во взрослом возрасте.

Заключение

В данном исследовании изучена связь полиморфизмов rs9939609 гена FTO и Ser447Ter гена LPL в детской и подростковой популяции г. Ростова-на-Дону (Россия). Выявлены генотипы повышенного и сниженного риска ожирения. Показана значительная связь между возникновением ожирения в с полиморфизмом rs9939609 гена FTO , а также отсутствие ассоциации локуса Ser447Ter гена LPL с ожирением: данный полиморфизм находится в антогонистических отношениях с полиморфизмом rs9939609 гена FTO . Также обнаружено значительное снижение этого показателя в контрольной группе.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания в сфере научной деятельности № 0852-2020-0028.