Атомно-силовая микроскопия морфологических и биофизических особенностей лимфоцитов крови при разных типах сахарного диабета

Введение. При сахарном диабете происходят нарушения углеводного и липидного обмена, развиваются аутоиммунные реакции, которые в свою очередь являются факторами риска развития сосудистых осложнений[1, 2]. В условиях гипергликемии, повышения содержания липопротеидов в крови, окислительного стресса закономерно возникают структурные нарушения клеточной мембраны, которые проявляются, в том числе и в изменениях биофизических свойств лимфоцитов крови [3, 4, 5]. Наиболее важными из них являются изменения упруго-эластических свойств, жёсткости мембран, шероховатости, которые определяют способность лимфоцитов к адгезии, перемещению по сосудам и хомингу. Структурная дезорганизация цитоплазматической мембраны лимфоцитов при сахарном диабете может создавать предпосылки к нарушению их функциональной активности в процессе развития инсулинозависимого (ИЗСД) и инсулиннезави-симого диабета (ИНСД). АСМ как один из ведущих прикладных нано-технологических методов исследования клеточных мембран в последнее время активно используется в ключевых областях биомедицины. Несмотря на то, что этот вид неоптической микроскопии появился сравнительно недавно, разработан целый спектр методических приёмов к измерению поверхностных локальных свойств мембраны различных клеток [1, 2]. Изучение биофизических свойств мембран и морфологических параметров живых лимфоцитов с помощью АСМ может дать существенную информацию о закономерностях указанных выше изменений у пациентов с сахарным диабетом [6, 7, 8, 9].

Цель исследования - изучить морфологические и биофизические особенности живых лимфоцитов пациентов с сахарным диабетом с помощью атомно-силовой микроскопии.

Материал и методы исследования. Материалом для исследования послужили лимфоидные клетки препаратов крови пациентов с инсулинозависимым (ИЗСД) и инсулиннезависи-мым сахарным диабетом (ИНСД). Исследованы препараты крови 20 пациентов отделения эндокринологии ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница № 1» Минздрава Ульяновской области. Пациенты с ИЗСД получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме. В качестве контроля использовали лимфоциты препаратов крови 10 практически здоровых добровольцев. Кровь стерильно забирали из локтевой вены в пробирки с гепарином в процедурном кабинете отделения эндокринологии ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница № 1» Минздрава Ульяновской области. На все виды исследований были получены разрешения локальной этической комиссии ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Минобрнауки РФ. Все исследования проводились с соблюдением прав и свобод, определённых законодательством РФ, этическими нормами и принципами в соответствии с Декларацией Хельсинки (1964) со всеми последующими дополнениями и изменениями, регламентирующих научные исследования на человеке, а также международным руководством для биомедицинских исследований с вовлечением человека (International ethical guidelines for biomedical research involving human subjects) Совета международных организаций медицинских наук (CIOMS). Все процедуры исследований были обезличены в соответствии требованиями п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».

Лимфоциты крови выделяли в градиенте плотности фиколла-верографина (ρ=1,092 г/см3). Полученную суспензию лимфоцитов объёмом 100 мкл культивировали в чашках Anumbra в растворе Хенкса при 37°С и 5% СО2 в течение 20 минут для обеспечения спонтанной адгезии к пластиковой подложке. Затем производили смену среды Хен-кса на питательную среду 199, содержащую 0,3 мг/ мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и инкубировали в ней клетки в течение 60 минут. Для анализа состояния мембраны лимфоцитов использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия). На каждом препарате проводили сканирование 15 и более лимфоцитов в контактном режиме в водной среде (рис. 1-А). Сканирование мембраны клеточной поверхности лимфоцитов крови проводили с использованием

Таблица.

Значения морфометрических и биофизических параметров лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и пациентов с разными типами сахарного диабета (M±σ)

Примечание: * - статистически значимые различия контрольной и опытной групп; # - статистически значимые различия опытных групп между собой кремниевых зондов серии PNP-DB-20 (NT-MDT) с жёсткостью 0,06 Н/м, радиусом закругления 10 нм. Полученные изображения поверхности клеточной мембраны лимфоцитов обрабатывали с помощью программы Nova (NT-MDT, Россия). Определяли следующие морфометрические параметры клеток: диаметр (d, µm) и высоту (h, µm) в микрометрах, площадь в квадратных микрометрах (S, µm2), объём клеток в кубических микрометрах (V, µm3) при помощи соответствующих опций программы (рис. 1-Б, 1-Г).

Для изучения биофизических параметров клеточной мембраны лимфоцитов в норме и при сахарном диабете оценивали модуль изометрического сжатия мембраны (модуля Юнга), характеризующего способность клетки к деформациям, возникающим при взаимодействии мембраны с вершиной зонда АСМ, при этом считали, что чем больше его значения, тем меньше упругие деформации клетки. Модуль Юнга клеточной мембраны лимфоцитов измеряли в мегапаскалях (MPa). Для расчёта модуля Юнга использовали модель Герца [10]. Из полученных серий силовых кривых (рис. 1-В) рассчитывали модуль Юнга в соответствии с моделью Герца для полусферического зонда [10]. Кроме этого, на основании морфологических данных, также полученных методом АСМ, вычисляли площадь соприкосновения клетки с подложкой, объём и коэффициент уплощённости по формуле для шарового сегмента, который выражали в относительных единицах [11].

Для характеристики шероховатости поверхности образцов использовали среднюю арифметическую шероховатость (Ra), измеряемую в нанометрах (nm, рис. 1-В). Сила адгезии зонда к мембране лимфоцитов определялась по участку силовой кривой отвода, соответствующему отрицательному изгибу кантилевера перед отрывом от поверхности клетки (рис. 1-Д). Силу адгезии мембраны лимфоцитов измеряли в наноньютонах (nN). Все полученные изображения сканированных поверхностей клеточных мембран обрабатывали в программе Nova 1.0.26.1443. Статистическую обработку производили с помощью программы «Statistica 8.0, StatSoft Inc. (США) Статистическую значимость различий оценивали на основе U-критерия Манна-Уитни, за значимые принимали различия на уровне значимости 95% (p<0,05).

Результаты ислледования и их обсуждение. В результате АСМ-сканирования получены следующие морфометрические данные характеризующие лимфоциты крови пациентов с сахарным диабетом. Лимфоциты крови здоровых доноров и пациентов с ИЗСД имеют диаметр более 11 мкм, а у пациентов с ИНСД диаметр лимфоцитов меньше на 16% (табл. 1, p<0,05). Для лимфоцитов пациентов с ИНСД характерно статистически значимое уменьшение площади и объема поверхности на 15% и 17% соответственно по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров и пациентов с ИЗСД (табл. 1, p<0,05). Показатель уплощенности лимфоцитов пациентов с ИНСД снижался на 15% по сравнению с лимфоцитами доноров и пациентов с ИЗСД (табл. 1, p<0,05). Морфометрические параметры лимфоцитов крови пациентов с ИЗСД превышают аналогичные параметры у пациентов с ИНСД (табл. 1). В крови пациентов с ИНСД преобладали лимфоциты меньших размеров, поверхность которых была менее шероховатой за счет уменьшения высоты разнообразной формы глобулярных выпячиваний, что может быть результатом реорганизации цитоскелета клеток [9, 12].

У пациентов с ИЗСД и ИНСД в живых лимфоцитах крови доказано увеличение величины модуля Юнга (модуля упругости) в среднем на 73% , по сравнению со здоровыми добровольцами (табл. 1, p<0,05). Для лимфоцитов крови при сахарном диабете характерно повышение жесткости и снижение упруго-эластических свойств не только для живых, но и фиксированных лимфоцитов [3, 6]. Повышение жесткости лимфоцитов, по данным литературы, может быть связано с изменениями структурных элементов цитоскелета и деградации фосфолипидного остова клеточной мембраны, затрудняющими их выход в сосудистое русло [9, 12]. Несмотря на это, сходные изменения жёсткости лимфоцитов при разных типах сахарного диабета не приводят к однотипным изменениям в морфометрических показателях клеток и биофизических свойствах клеточной мембраны. При ИЗСД нативные лимфоциты более распластаны по подложке, чем лимфоциты пациентов с ИНСД, об этом свидетельствует более высокие значения силы адгезии и шероховатости клеток пациентов с ИЗСД (табл.1).

Величина клеточной адгезии отражает динамику изменений цитоскелетной организации и адгезионных взаимодействий между клеткой и субстратом. При анализе адгезионных карт методом АСМ, снятых с силовых кривых установлено, что адгезия цитолеммы лимфоцитов пациентов с ИЗСД увеличивается на 42,5% по сравнению с показателями здоровых доноров (р<0,05). При ИНСД показатели адгезии лимфоцитов крови снижаются на 28 и 58% соответственно с показателями здоровых доноров и пациентов с ИЗСД (табл. 1, p<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при сахарном диабете происходит значительное повышение жёсткости мембран лимфоцитов крови по сравнению с аналогичными показателями крови здоровых людей. Адгезивные свойства и рельеф поверхности лимфоцитов при разных типах сахарного диабета различаются. У пациентов с ИЗСД значения силы адгезии и шероховатости клеток выше, чем у пациентов с ИНСД. Морфометрические параметры лимфоцитов крови пациентов с ИЗСД также превышают аналогичные параметры пациентов с ИНСД. Выявленные морфологические и биофизические особенности живых лимфоцитов крови пациентов с разными типами сахарного диабета с помощью атомно-силовой микроскопии могут иметь патогенетическое значение в развитии иммунологических нарушений, возникающих при этом заболевании.