Автоматизированный и ручной анализ спермы: сравнительная характеристика

(4).704

Belyaeva LA, Shurygina OV, Yukhimets SN, Petrova AA, Mironov SYu, Ratenkova NV, Kulakova OV, Bovtunova SS. Automated and manual semen analysis: the comparative characteristics. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2022;30(4):704. (4).704

Введение. Исследование эякулята является наиболее простым и доступным методом лабораторного исследования фертильности мужчин. Спермограмма является результатом исследования физических, количественных, биохимических, иммунологических и морфологических показателей эякулята [1]. Существует два метода анализа спермы: ручной и автоматизированный, с помощью анализаторов SQA-V и СASA. В большинстве лабораторий вручную оценивают сперму под микроскопом. Однако традиционный ручной анализ спермы имеет ограничения, о чем свидетельствуют исследования, демонстрирующие межлабораторную вариабельность, приводящую к противоречивым результатам, которые в свою очередь могут привести к неверной диагностике или отсрочке лечения бесплодных пар [2]. Внедрение автоматических анализаторов спермы показало, что их можно рассматривать как альтернативный подход к рутинному ручному анализу спермы, который может способствовать лабораторной стандартизации. Первоначально эти системы продемонстрировали трудности с точным указанием концентрации сперматозоидов из-за наличия агрегации сперматозоидов и большого количества фонового дебриса (клеточного мусора) [3-4].

В нашем исследовании мы использовали результаты компьютерного анализа спермы (CASA, MICROPTIC, Spain), существующего с 1985 года. Технология CASA в основном оценивает характеристики движения сперматозоидов. Основная проблема автоматической системы CASA заключается в истинной идентификации и дифференцировке сперматозоидов от других объектов аналогичного размера, таких как круглые клетки, цитоплазматические капли и клеточный мусор [5]. По данным современных исследований существует корреляция между содержанием прогрессивно-подвижных и нормальных морфологических форм [1, 6-7]. Ранние исследования демонстрировали положи- тельную корреляцию между процентом сперматозоидов с нормальной морфологией и частотой зачатия, однако в поздних работах эти результаты не нашли подтверждения. Исследование строения сперматозоидов на сегодняшний день часто остается отправной точкой обследования мужчины по поводу бесплодия. Однако имеющиеся данные не подтверждают роли этого фактора в выборе метода вспомогательных репродуктивных технологий или прогнозировании их результатов. Таким образом, данные о прогностической значимости исследования морфологии сперматозоидов противоречивы [8]. Авторы решили сосредоточиться на анализе концентрации сперматозоидов ручным и автоматизированным способом.

Цель исследования: определить наличие или отсутствие различий данных при выполнении спермограммы ручным и автоматизированным способом.

Материалы и методы исследования. Всего было проведен анализ 50 образцов спермы. Все пациенты проходили первичное обследование в отделении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) Клинического госпиталя ИДК «Мать-и-дитя» (г. Самара). Один образец спермы был разделен на две порции: для ручного проведения спермограммы (I группа) и автоматизированного анализа (II группа). Микроскопическое исследование эякулята проводили после полного его разжижения. Ручной анализ проводили в камере Маклера по стандартной методике в 10 малых квадратах. В соответствии с рекомендациями ВОЗ различают следующие категории сперматозоидов: категория А -движение сперматозоида прямолинейное и поступательное, скорость выше 0,025 мм/с; категория В - сперматозоид движется прямолинейно, но его скорость меньше 0,025 мм/с, как правило, это сперматозоиды либо стареющие, либо с нарушенным строением; категория С - сперматозоид вращается на месте или по кругу, то есть его движение не поступательное; катего- рия D - сперматозоид неподвижен (азооспермия). Примерно 50% всех сперматозоидов группы D — это старые спермии, которые либо уже погибли, либо погибают. Подвижность каждого сперматозоида в настоящем исследовании классифицировали по указанным выше категориям. Сначала подсчитывали все сперматозоиды категорий «А» и «В» в 10 малых квадратах в %. Далее в той же области подсчитывают сперматозоиды с непоступательным движением категории «С» в% и неподвижные сперматозоиды категории «D».

Автоматизированный анализ проводился с помощью системы компьютерного анализа спермы на анализаторе спермы CASA (MICROPTIC, Испания), который использует принцип получения микроскопических изображений и их обработки для обнаружения подвижных и неподвижных сперматозоидов посредством получения быстрых и последовательных кадров. При автоматизированном анализе подвижности сперматозоидов с помощью системы САSA оцениваются кинематические параметры сперматозоидов, например, VCL (скорость криволинейного движения), LIN (линейность), ALH (амплитуда латерального смещения головки) and STR (прямолинейность), которые важны для определения: прогрессивной подвижности сперматозоида и циркулярной подвижности. CASA обеспечивает дифференциацию на быстрые прогрессивные сперматозоиды; быстрые, но менее прогрессивные; медленные непрогрессивные; неподвижные. Эти количественные измерения используются для точного отнесения к тому или иному классу в соответствии с ВОЗ 4/5. Статистический анализ проводился с использованием программы RStudio (R v.3.6.3, RStudio v.1.1.463). Описательная статистика для непрерывных данных рассчитывалась как среднее значение и 95% доверительные интервалы; для непараметрических данных как медиана, квартили и межквартильный диапазон. Несмотря на то, что данные не соответствовали нормальному распределению, в группах было больше 30 наблюдений, что, согласно центральной предельной теореме, позволяет нам использовать среднее значение и 95% доверительные интервалы для описания переменных. При оценке различий в непараметрических группах данных использовались критерий Манна-Уитни для двух групп сравнения. Для оценки различий в процентах использовался критерий χ2. Данные были разделены на группы по способам оценки на группу автоматизированного и группу ручного подсчета. Расчет размера выборки был основан на пилотном исследовании и рассчитан с использованием формулы для теста пропорции; уровень p<0,05 считался статистически достоверным и указан для групп сравнения, в которых он был достигнут.

Результаты исследования и обсуждение. Средний возраст пациентов в рамках проведенного исследования составил 36 лет. Распределение пациентов по возрасту представлено на рис. 1.

Рис. 1. Распределение исследованных пациентов по возрасту

С помощью статистического анализа при сопоставлении двух групп по анализируемым параметрам (концентрация, процентное соотношение категорий сперматозоидов по уровню подвижности) было показано, что метод 95% доверительных интервалов указывает на разницу между автоанализом и ручным способами оценки спермы в отдельных категориях (таблица 1). Так, обнаружена статистически значимая разница между автоматизированным и ручным анализом в группе сперматозоидов категории A в 5,31 (95%

ДИ: 3,31-7,31) против 11,31 (95% ДИ: 8,3714,65, р<0,001) и в группе А+В - 22,13 (95% ДИ: 16,37-27,88, р<0,001) против 28,08 (95% ДИ: 22,73-33,43, р=0,036). Вероятнее всего это связано с объективной трудностью визуальной оценки сперматозоидов категории А, обладающих наиболее высокой скоростью и требующих большого опыта персонала для их оценки. Статистически значимая разница для группы А+В, судя по всему, объясняется влиянием данных за счет группы А. Показатели в группе ручного анализа значимо выше по категории А и почти в 2 раза выше в категории С -26,71 (95% ДИ: 22,51-30,91, р<0,001) против

20,12 (95% ДИ: 17,29-22,94, p=0,079). Полученные данные позволяют нам предположить, что автоматизированный анализ обладает более высокой степенью объективизации данных при оценке подвижных биологических объектов, в данном случае - мужских гамет.

Помимо анализа с определением доверительных интервалов, мы провели также попарное сравнение групп категорий сперматозоидов при автоматизированном и ручном способах оценки с определением коэффициента Манна-Уитни для непараметрических выборок (таблица 2).

Таблица 1

Сравнение методом доверительных интервалов основных показателей эякулята при использовании автоматизированного и ручного способов оценки

Показатели	Группа	N	Mean	SE	Lower	Upper	Med	SD	IQR	W	p=
Общая	auto	50	64,25	7,46	49,63	78,87	56,14	52,73	75,05	0,87	<0,001
клеток	manual	50	62,08	6,79	48,77	75,39	55,50	48,00	69,75	0,88	<0,001
A	auto	50	5,31	1,02	3,31	7,31	2,21	7,20	5,75	0,73	<0,001
	manual	50	11,51	1,60	8,37	14,65	9,00	11,33	14,57	0,88	<0,001
B	auto	50	16,80	2,12	12,65	20,96	13,26	14,98	21,34	0,88	<0,001
	manual	50	16,55	1,76	13,09	20,01	13,40	12,47	18,42	0,93	0,004
A+B	auto	50	22,13	2,94	16,37	27,88	15,56	20,76	27,09	0,87	<0,001
	manual	50	28,08	2,73	22,73	33,43	24,00	19,31	30,75	0,95	0,036
C	auto	50	26,71	2,14	22,51	30,91	24,10	15,15	13,55	0,81	<0,001
	manual	50	20,12	1,44	17,29	22,94	19,50	10,19	13,00	0,96	0,079
D	auto	50	51,18	3,77	43,80	58,57	54,20	26,64	43,00	0,95	0,029
	manual	50	51,56	3,54	44,61	58,50	50,20	25,04	38,45	0,97	0,169

Примечание: auto – автоматический анализ; manual – ручной способ подсчета сперматозоидов; N – число наблюдений, Mean – средняя арифметическая, SE – ошибка средней, Lower – нижний квартиль, Upper – верхний квартиль, Med – медиана, SD – среднее квадратичное отклонение, IQR – межквартильный размах, W – значение критерия Манна-Уитни, p – значение уровня достоверности различий

При сравнении показателей двух групп по категориям сперматозоидов «А+В» почти достигнута статистически значимая разница. Статистически достоверная разница при сравнении показателей для ручного и автоматизированного анализа данных, обнаруживается также при подсчете сперматозоидов категории «А» и «С», несмотря на то, что доверительные интервалы для категории «С» пересекаются. Таким образом, в целом с помощью статистических методов анализа, удалось определить значимую разницу показателей при автоматизированном и ручном способах оценки эякулята для сперматозоидов категории «А». Для категории «А+В» методом доверительных интервалов также была обнаружена статистически значимая разница, которая имеет относительное подтверждение при расчете критерия различий Манна-Уитни. При сравнении двух способов оценки эякулята при расчете критерия различий Манна-Уитни для категории сперматозоидов категории «С» обнаружена статически значимая разница, которая была по- чти достигнута в настоящем исследовании методом сравнительных интервалов. Возможно, большее количество исследований может достичь более статистически значимой разницы. В нашем исследовании обнаружена положительно значимая корреляция между двумя основными показателями спермограммы - общей их концентрацией и концентрацией разных катего-

рий сперматозоидов, преимущественно средней и умеренной силы при обоих методах исследованиях эякулята. Отрицательная корреляция при использовании ручного и автоматизированного методов обнаружена для показателя концентрации сперматозоидов категории «D» и общей концентрации клеток в эякуляте.

Таблица 2

Показатели основных параметров эякулята при использовании автоматизированного и ручного способов оценки с определением коэффициента Манна-Уитни

Показатели	Статистический критерий	Значение критерия	Число степеней свободы	p=	Средняя разница	Ошибка средней разницы
Объем	Student’s t	0,00	98,00	1,000	0,00	0,19
	Mann-Whitney U	1250,00		1,000	0,00
Общая	Student’s t	0,22	98,00	0,830	2,17	10,08
концентрация клеток	Mann-Whitney U	1247,00		0,986	0,16
A	Student’s t	–3,27	98,00	0,002	–6,20	1,90
	Mann-Whitney U	842,50		0,005	–4,51
B	Student’s t	0,09	98,00	0,927	0,25	2,76
	Mann-Whitney U	1187,50		0,669	–0,89
AB	Student’s t	–1,48	98,00	0,141	–5,95	4,01
	Mann-Whitney U	983,50		0,067	06,36
C	Student’s t	2,55	98,00	0,012	6,59	2,58
	Mann-Whitney U	874,00		0,010	5,33
D	Student’s t	–0,07	98,00	0,943	–0,37	5,17
	Mann-Whitney U	1242,00		0,959	0,29

Заключение. Спермограмма является универсальным критерием для определения оплодотворяющей способности спермы у мужчины и позволяет проанализировать активность и функциональное состояние половых клеток и, как следствие, оценить репродуктивные способности мужчины, принять решение о необходимости лечения и разработать его тактику [9-19]. В соответствии с результатами проведенного исследования с использованием метода определения доверительных интервалов, применение автоматизированного анализа спермограммы позволяет более объективно выделить сперматозоиды категории «А» в исследуемом образце. Концентрация сперматозоидов категорий