Bacillus megaterium 501RIF как антидот гербицида прометрина в посевах овса и кукурузы

Гербицид прометрин — 4,6-бис-(изопропиламино)-2-метилтио-1,3,5- триазин широко и эффективно применяется для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорняками в посевах кукурузы, хлопчатника, сои, картофеля, а также овощных и зеленных культур (1, 2). Его персистентность (Т50) в почве в зависимости от дозы, почвенно-климатических условий и агротехнических приемов использования составляет от нескольких недель до 18 мес (3, 4). Длительное присутствие гербицида в почве обусловливает ряд проблем агротехнологического и экологического характера. С агрономической точки зрения они связаны прежде всего с чередованием сельскохозяйственных культур в севообороте. Имеется значительный риск снижения урожая и даже гибели чувствительных к гербициду растений, высеянных по предшественнику, обработанному прометрином. С экотоксикологи-ческой точки зрения следует отметить, что, несмотря на относительно низкую подвижность, прометрин и продукты его трансформации вымываются из почвы в окружающие водоемы, оказывая отрицательное влияние на водную растительность и подрывая кормовую базу гидробионтов (5, 6).

Основные факторы разложения гербицидов — физико-химические свойства почвы и микроорганизмы (6, 7). Из почвы выделены бактерии, использующие прометрин в качестве источника углерода (8), азота (9, 10) и серы (11). По данным Ю.В. Круглова с соавт. (12), в почве, инокулированной культурой Bacillus megaterium 501^rif, наблюдалось ускоренное разложение гербицида. Некоторые штаммы B. megaterium продуцируют поли-бета-гидрокимасляную кислоту. Установлено, что обработка посевов препаратом, содержащим это вещество, повышает устойчивость растений к стрессам, включая некоторые пестициды (13). На основе B. megaterium созданы препараты, которые используются в растениеводстве для повышения урожая сельскохозяйственных культур (14, 15). Вместе с тем практически отсутствуют работы, в которых изучено влияние этих микроорганизмов на устойчивость растений к гербицидам, широко и повсеместно используемым в современных агротехнологиях.

В настоящем исследовании получены новые данные о последствиях инокуляции B. megaterium 501^rif для растений в отношении их устойчивости к гербициду прометрину. Впервые показано, что культура B. megaterium 501^rif снижает фитотоксичность гербицида и разлагает его в ризосфере овса и кукурузы.

Целью работы было изучение приживаемости культуры Bacillus megaterium 501^rif в ризосфере овса и кукурузы, оценка ее влияния на устойчивость растений к прометрину и эффективность разложения этого гербицида в почве.

Методика . Вегетационные опыты проводили на экспериментальной базе ФГБНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин).

• B.    megaterium 501^rif (мутант, устойчивый к антибиотику рифампицину) был получен методом градиентного отбора из исходного штамма, выделенного нами из чернозема обыкновенного (Кокчетавская обл., Казахстан). Исходный штамм депонирован в Коллекции непатогенных полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии) (16).

• B.    megaterium 501^rif выращивали на ротационной качалке в течение 48 ч при 30 ° С и 140 об/мин. Состав питательной среды был следующим (г/л): K 2 HPO 4 — 1,6; KH 2 PO 4 — 0,4; NH 4 NO 3 — 0,5; MgSO 4 — 0,2; CaCO 3 — 0,05; FeSO 4 — 0,025; дрожжевой экстракт — 0,2; сахароза — 10,0; рН 6,8. Титр бактерий составлял 5½10⁸ КОЕ/мл (не менее 90 % вегетативных клеток).

Накопление поли-бета-гидроксимасляной кислоты (в виде гранул) в клетках B. megaterium 501^rif исследовали методом фазово-контрастной микр-скопии (Axio Lab. A1, «Carl Zeiss», Германия).

Семена овса посевного ( Avena sativa L.) сорта Победа и кукурузы ( Zeal mays L.) сорта Росс 199 Мв инокулировали 2-суточной жидкой культурой B. megaterium 501^rif, после чего высаживали в вегетационные сосуды объемом 2,0 кг. Почва — дерново-подзолистая среднесуглинистая, с содержанием органического вещества 2,3 %, рН сол. 5,8. Гербицид прометрин в виде водной суспензии смачивающегося порошка («Panama Agrochemical Inc.», Панама) вносили в количестве 0,0 (без гербицида), 0,12; 0,22; 0,67 и 1,23 мг/кг в опыте с овсом и 0,0 (без гербицида), 3,4; 6,8 и 20,4 мг/кг — с кукурузой. В последнем случае дополнительно был введен вариант с парующей почвой, содержащей прометрин (6,8 мг/кг). Почву тщательно перемешивали и расфасовывали. Контролем служили аналогичные варианты без инокуляции.

Растения выращивали в световой камере Фитос-4 (ФГУП «Фитос», Россия) при температуре 22-25 ° С. Влажность почвы составляла 50-60 % от полной влагоемкости. Повторность опыта 3-кратная.

Сухую биомассу растений, содержание прометрина в почве и численность B. megaterium 501^rif в ризосфере овса и кукурузы учитывали спустя 30 сут после появления всходов. Количество бактерий определяли методом серийных разведений (17) на агаризованной минеральной среде указанного выше состава с добавлением 2,5 % агара («Difco», США) и 0,02 г/л антибиотика рифампицина. Для дифференцированного определения спор бактерий почвенную суспензию перед посевом на питательную среду пастеризовали 10 мин при 80 ° С. Гербицид экстрагировали из почвы ацетоном с последующим количественным определением на газовом хроматографе Цвет-106 (НПО «Химавтоматика», Россия) с термоионным детектором (18). Степень экстракции прометрина из почвы составляла 65-70 % от расчетного количества.

Полевой опыт проводили в 2010 году (опытное поле Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин, Ленинградская обл.). Размер делянок — 1 м², повторность 3-кратная. Почва — дерновоподзолистая среднесуглинистая, с содержанием органического углерода 2,3 %, рН 5,6. Гербицид прометрин вносили в верхний слой почвы на глубину 0-10 см в дозе 500 мг/м², что, по данным анализа, соответствовало 1,5 мг/кг. Семена кукурузы сорта Росс 199 Мв перед посевом инокулировали жидкой культурой B. megaterium 501^rif с титром 5½10⁸ КОЕ/мл. В контрольном варианте инокуляцию не проводили. Наземную массу растений, содержание гербицида в почве и титр бактерий определяли спустя 30 сут после появления всходов.

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel. Рассчитывали средние значения показателей ( M ) и среднеквадратические отклонения (±SD). Достоверность результатов оценивали на уровне доверительной вероятности Р 0,95.

Результаты. В вегетационном опыте гербицид прометрин в количестве 0,12 мг/кг оказывал незначительное стимулирующее действие на рост овса. Биомасса растений по сравнению с вариантом без гербицида возрастала на 11 % (Р 0,05 ) (рис. 1). Дозы прометрина выше 0,22 мг/кг ингибировали рост растений, а при 1,23 мг/кг уже через 2 нед происходила их гибель.

Инокуляция семян овса культурой B. megaterium 501^rif приводила к снижению фитотоксического эффекта прометрина и достоверному (Р 0,95 )

увеличению наземной массы растений по сравнению с контролем (без инокуляции) независимо от содержания гербицида в почве. Культура B. megaterium 501^rif хорошо приживалась в ризосфере овса, причем от 58 до 80 % бактерий находилось в виде физиологически активных вегетативных клеток. Спустя 1 мес после появления всходов содержание прометрина в почве снижалось, при этом в опытном варианте, где семена инокулировали культурой бактерий, его было в 1,5-3,0 раза меньше, чем в контроле (табл.). Следовательно, B. megaterium 501^rif оказывала протекторное действие на растения овса, повышая их устойчивость к гербициду, а также снижала содержание гербицида в почве, что, в свою очередь, уменьшало его фито-токсический эффект.

Аналогичное действие прометрин оказывал на кукурузу, однако ее устойчивость была на порядок выше, чем у овса (см. рис. 1). Ингибирующий эффект гербицида проявлялся при концентрации 20,4 мг/кг. Меньшие концентрации стимулировали рост растений. Инокуляция бактериями семян кукурузы полностью снимала фитотоксический эффект гербицида. При этом биомасса растений по сравнению с неинокулированными вариантами опыта возрастала в 1,5-3,0 раза (Р 0,95 ).

Бактерии B. megaterium 501^rif прекрасно приживались в ризосфере растений, достигая численности 335 тыс. КОЕ г/почвы (см. табл.). Через 30 сут после всходов содержание гербицида в почве под кукурузой снижалось в 20 раз, а при инокуляции бактериями — в 60 раз по сравнению с парующей почвой. Следовательно, в деградации гербицида участвовали как растения, так и бактерии B. megaterium 501^rif, присутствующие в ризосфере.

Рис. 1. Сухая масса растений овса посевного ( Avena sativa L.) сорта Победа (А) и кукурузы ( Zeal mays L.) сорта Росс 199 Мв (Б) под влиянием гербицида прометрина при инокуляции семян культурой Bacillus megaterium 501^rif (30-е сут после появления всходов): а — контроль (без инокуляции), б — опыт (вегетационный опыт, вертикальные отрезки — среднеквадратические отклонения).

Содержание прометрина и бактериального инокулянта Bacillus megaterium 501^rif в почве под овсом посевным ( Avena sativa L.) сорта Победа и кукурузой ( Zeal mays L.) сорта Росс 199 Мв (30-е сут после появления всходов) (вегетационный опыт, M ±SD)

Почва	Прометрин, мг/кг			B. megaterium 501rif, КОЕ тыс/г
	исходное	30-е сут
		без инокуляции	инокуляция семян B. megaterium 501rif	общее число	споры, % от общего числа
Под овсом	0,22±0,03	< 0,02	< 0,02	500±70	20,0
Под овсом	0,67±0,04	0,59±0,02	0,18±0,03	550±65	27,0
Под овсом	1,23±0,03	0,93±0,15	0,58±0,07	350±33	42,0
Под кукурузой	6,80±0,05	0,22±0,02	0,07±0,02	335±40	12,0
Почва (без кукурузы)	6,80±0,05	4,50±0,07

Учитывая высокую эффективность деградации гербицида под по- кровом кукурузы, провели оценку влияния бактерий на накопление зеленой массы растений и деградацию прометрина в почве в условиях микроделя-ночного полевого опыта. Через 30 сут после появления всходов масса растений в контроле составляла 257±15 г/м2, в то время как при инокуляции B. megaterium 501rif — 287±20 г/м2, или на 12 % больше показателя в контроле. Разница между вариантами опыта практически отсутствовала. Содержание гербицида в почве в варианте с инокуляцией уменьшалось почти в 3 раза по сравнению с контролем — 0,15±0,03 против 0,45±0,10 мг/кг, что согласуется с результатами вегетационного опыта.

Рассматривая причины положительного эффекта B. megaterium 501^rif, следует обратить внимание на то, что у инокулированных бактериями растений существенно изменяется архитектура корневой системы за счет более интенсивного развития боковых корней (19), ускоряется формирование генеративных органов (20), возрастает суммарное содержание фотосинтетических пигментов в листьях (21).

Рис. 2. Клетки Bacillus megaterium 501^rif, наполненные гранулами поли-бета-гидроксимасляной кислоты (микроскоп Axio Lab. A1, «Carl Zeiss», Германия, фазовый контраст) .

Среди продуктов жизнедеятельности этих микроорганизмов обнаружены ауксины и витамины группы В (22), а также поли-бета-гидроксимасляная кислота (23-26), которые оказывали положительное влияние на формирование корневой системы растений и фотосинтез. Содержание поли-бета-гидроксимасяной кислоты в клетках B. megaterium составляло от 10 до 80 % от массы бактерий в зависимости от штамма и условий культивирования (2325). Полученный нами штамм

B. megaterium 501^rif при росте на жидкой среде также интенсивно синтезировал и накапливал в вегетативных клетках гранулы поли-бета-гидрокси-масляной кислоты (рис. 2).

Результаты испытаний препарата Альбит (ООО «Научно-производственная фирма «Альбит», Россия), основным действующим веществом которого служит поли-бета-гидроксимасляная кислота, показали высокую эффективность его применения в посевах ряда сельскохозяйственных культур на фоне различных по химическому составу гербицидов (13, 27). А.К. Злотников с соавт. (13, 27) рассматривают Альбит как универсальный антистрессовый препарат, обладающий свойствами антидота по отношению к применяемым в сельском хозяйстве ядохимикатам. По мнению авторов, механизм его протекторного действия на растение связан прежде всего с положительным влиянием поли-бета-гидроксибутирата на фотосинтез. Исходя из этого, можно полагать, что протекторное действие B. megaterium 501^rif на растения в наших опытах с высокой долей вероятности было связано с положительным эффектом продуктов жизнедеятельности бактерий, прежде всего поли-бета-гидроксимасляной кислоты.

Особый интерес представляют результаты опытов с кукурузой. Известно, что кукуруза поглощает и разлагает триазиновые гербициды. При этом значительную роль играют ферменты, участвующие в реакции гидроксилирования (28). Установлено, что при трансформации прометрина растением и микроорганизмами образуется значительное количество продуктов метаболизма, среди которых основное место занимают сульфоксид, сульфон, гидроксипропазин, а при последующей трансформации гидроксипропазина возможно образование амелина, амелида и циануровой кислоты. Продукты гидролиза и N-деалкилирования сим-триазинов образуют конъюгаты с глю-татионом и сахарами (6, 28).

До сих пор основное внимание исследователей было сосредоточено на изучении гербицидного эффекта прометрина и продуктов его трансформации (29). Имеется очень мало данных об их положительном действии на растения. Так, в опытах Е.В. Лебедева (30, 31) малые дозы прометрина повышали чистую продуктивность фотосинтеза, поглощение азота и фосфора сеянцами сосны обыкновенной и кедра сибирского. В работе H.M. Nadar с соавт. (32) наблюдалось стимулирующее действие сим-триазиновых гербицидов, включая метилтиопризводные (прометрин и аметрин), на рост каллуса сорго и синтез белка, на основании чего авторы пришли к выводу о гормональном кинин-подобном действии малых концентраций сим-триазинов на растение. Триазиновые гербициды оказывают влияние на ионный баланс растений и, соответственно, на синтез ДНК, белков и энзимов (33), поэтому не исключено, что высокая эффективность инокуляции кукурузы культурой B. megaterium 501^rif на фоне прометрина обусловлена синергическим эффектом продуктов жизнедеятельности бациллы, гербицида и продуктов его трансформации.

Таким образом, инокуляция семян овса и кукурузы культурой Bacillus megaterium 501^rif оказывала положительное влияние на рост растений. Причем эффективность инокуляции на фоне гербицида прометрина была выше, чем в контроле. Также повышалась устойчивость растений к промет-рину и ускорялось его разложение в ризосфере. Следовательно, культура бактерий B. megaterium 501^rif и продукты ее жизнедеятельности, в частности поли-бета-гидроксимасляная кислота, служат протекторами, или антидотами, снимающими фитотоксический эффект прометрина. Показано, что кукуруза, инокулированная B. megaterium 501^rif, в условиях вегетационного и микрополевого опытов проявила себя как биомелиорант, эффективно очищающий почву от прометрина. Это открывает перспективы для использования инокулированной бациллой кукурузы в биоремедиации загрязненной гербицидом почвы.