Bacillus thuringiensis из природных субстратов в Ленинградской области: выделение и идентификация

Высокие адаптивные возможности аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus thuringiensis в различных экстремальных условиях обусловливают их широкое распространение в природе. Есть сообщения о выделении бацилл из горных источников (1). По данным ряда авторов (26), спорообразующие бактерии широко распространены в почве. Описаны штаммы бацилл, которые способны расти при отрицательных температурах ниже 45-50 ° С, а споры выдерживают нагревание до 102 ° С (7).

Раньше считалось, что основными объектами скрининга на наличие кристаллообразующих бактерий служат больные или погибшие насекомые из естественных популяций. Однако в настоящее время установлено, что эти микроорганизмы встречаются повсюду: в почве, воде, растениях, в живых насекомых, в трупах насекомых, в лесной подстилке, местах

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение ¹ 14.604.21.0024, RFMEFI60414Х0024).

проживания насекомых (8-13). Варианты энтомопатогенов имеют свои ареалы, связанные с расселением насекомых-хозяев. Бактерии B. thur-ingiensis широко распространены в Крыму, где поражают многие виды насекомых, что объясняется благоприятными условиями региона с теплым и сухим климатом. Для Азии характерно выделение B. sotto и B. dendrolimus , для США — B. thuringiensis , B. entomocidus и B. finitimus . В Европе для областей Франции, где растет шелковица, типичны штаммы B. alesti (14, 15). Однако в последние годы одни и те же разновидности B. thur-ingiensis были выделены на разных по природным условиям континентах независимо от наличия и плотности популяции насекомого-хозяина (16-19). Ежегодно группа B. thuringiensis пополняется разновидностями (серотипами), различающимися между собой не только таксономически, но и по спектру энтомоцидного действия (20-29). К настоящему времени учеными разных стран выделено и идентифицировано более 70 разновидностей B. thuringiensis . К достоинствам этих бактерий относится их безопасность для человека, теплокровных животных, полезных насекомых и окружающей среды (30, 31).

Целью настоящего исследования было выделение бактерий, принадлежащих к группе thuringiensis , их идентификация и отбор штаммов, перспективных в качестве продуцентов биопрепаратов энтомоцидного действия в отношении вредных насекомых.

Методика . В г. Санкт-Петербурге, его пригородах и Ленинградской области были собраны 24 образца из различных источников (почва, лесная подстилка, части растений, больные и погибшие насекомые, вода, ил).

При выделении микроорганизмов из насекомых каплю гемолимфы или суспензию тканей больных насекомых стерильно смешивали с физиологическим раствором и стерильно вносили в чашки Петри на рыбный агар (РА) методом истощающегося мазка. Таким же образом проводили рассев из других субстратов (почва, листва и т.д.). Чашки инкубировали при 28-30 ° С и на 7-е сут с помощью микроскопирования мазков с использованием черного анилинового красителя (32) выявляли культуры, способные формировать кристаллический эндотоксин.

Предварительный скрининг изолятов осуществляли по признакам энтомо- и ларвицидности, идентификацию отобранных вариантов — по схемам для B. thuringiensis (Bt), предложенным H. De Barjac, A.A. Bonnefoi (33) и O. Lysenko (34).

Для изучения биохимических свойств изолятов вместо жидких дифференциально-диагностических сред использовали системы индикаторных бумажных (СИБ) дисков (ФГУП НПО «Микроген» МЗРФ, Россия), содержащих определенные количества субстрата в сочетании с соответствующим индикатором и стабилизированных с применением пленкообразующего покрытия — поливинилового спирта. При определении способности использовать углеводы в 0,3 мл стерильного 0,85 % раствора NaCl (рН 7,3±0,1) суспендировали суточную агаровую культуру (объем — одна микробиологическая петля), выращенную при температуре 29±1 ° С, и в пробирку погружали диск с соответствующим углеводом. Контролем служили диски, погруженные в стерильный 0,85 % раствор NaCl. Результаты учитывали через 5-18 ч. Аналогичным образом с применением СИБ-дисков оценивали индолообразование, уреазную активность, продукцию сероводорода и ацетилметилкарбинола (АМК).

Продуктивность изолятов определяли на дрожже-полисахаридных средах при выращивании глубинным способом в колбах Эрленмейера на качалке с аэрацией (220 об/мин) в течение 72 ч при 28 °С. Титр клеток учи- тывали общепринятым методом серийных разведений с высевом на РА.

Биологическую активность изолятов устанавливали, исходя из титра энтомопатогена, вызывающего летальный эффект у 50 % тестируемых насекомых при свободном поглощении инокулированного корма. Готовили несколько разведений жидкой бактериальной культуры, обеспечивающих от 10 до 96 % гибели тест-объекта. Каждый вариант испытывали в трех повторностях; в контроле корм не инокулировали.

Для оценки биосинтеза термостабильного экзотоксина жидкую культуру изолята центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость автоклавировали при 105 ° С в течение 20 мин. В стеклянные банки объемом 200 мл вносили 11 мл 2,5 % водной суспензии сухого молока, 7 г пшеничных отрубей и 2 мл надосадочной жидкости (экзотоксина) соответствующего разведения (в контроле — 2 мл стерильной воды). В каждой банке находилось 20 г субстрата (корма) и 2 мл надосадочной жидкости (0,1 мл/г, или 100 мкл/г). Использовали надосадочную жидкость без разведения и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, которым соответствует 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; 3,125 мкл экзотоксина/г. На субстрат помещали по 25 личинок комнатной мухи Musca domestica 3-суточного возраста. Банки устанавливали в термостат при температуре 28 ° С и на 5-е сут отбирали пупарии. Учитывали вылетевших мух, процент погибших ( Х ) с поправкой на гибель в контроле вычисляли по формуле W.S. Abbot (35):

X = K-B х 100 % ,

K где К и В — число вылетевших мух соответственно в контроле и опыте. ЛК50, выраженную как количество экзотоксина в микролитрах в расчете на 1 г корма, рассчитывали по формуле Кербера (36).

Энтомоцидную активность оценивали на личинках 2-го возраста колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. Готовили водную суспензию культуральной жидкости (КЖ) в трех разведениях — 1:10, 1:50 и 1:250, что соответствует содержанию 10; 2 и 0,4 %. Ветку картофеля с пятью листьями обрабатывали с двух сторон бактериальной культурой в соответствующем разведении (контроль — опрыскивание водой), помещали в пенициллиновый флакон с водой и под углом 45 ° ставили в кристаллизатор с фильтровальной бумагой на дне. На каждую ветку сажали кисточкой по 25 личинок. Чашки оставляли при комнатной температуре (22-25 ° С) на 3 сут, после чего корм заменяли свежим (без обработки). Погибших личинок учитывали на 7-е сут. Процент смертности вычисляли по формуле W.S. Abbot для каждого разведения препарата с поправкой на гибель в контроле (35). ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (36).

При определении восприимчивости гусениц мельничной огневки Ephestia kuehniella к изолятам тестировали культуральную жидкость. В стеклянные банки объемом 200 мл с 5 г пшеничной муки вносили по 2 мл КЖ соответствующего разведения (1,0; 0,5 и 0,25 %), помещали по 25 гусениц 2-го возраста, выдерживали в термостате при температуре 26 ° С и учитывали гибель на 10-е сут. ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (36).

Ларвицидную активность изолятов оценивали по методике, предложенной Всемирной организацией здравоохранения (37), на личинках комаров Aedes aegypti 4-го возраста инсектарой популяции. Готовили суспензию КЖ методом ее разведения в 200, 400, 800 и 1600 тыс. раз, что соответствует условному содержанию КЖ 0,5½10-3; 0,25½10-3; 0,125½10-3; 0,0625½10-3 %, или 5,0; 2,5; 1,25; 0,625 мкл КЖ/л. Все разведения готовили на водопроводной воде. В чашку Петри наливали по 50 мл соответствую- щего разведения и помещали по 25 личинок комаров. Чашки ставили в термостат на 24 ч при 28-30 °С, после чего учитывали гибель личинок. Процент смертности для каждой концентрации с поправкой на гибель в контроле вычисляли по формуле:

Х = 1М00о - ММкк ½ 100 %, где Мо и Мк — средние арифметические числа мертвых особей соответственно в опыте и контроле. На основании полученных данных рассчитывали ЛК50, выраженную в процентах гибели личинок по формуле Кербера (20): lg ЛК50 = lg CM — □ (LX2 — 0,5), где СМ — максимальное содержание из испытанных; □ — логарифм отношения для каждого предыдущего разведения к последующему (логарифм кратности разведений); ∑Х2 — сумма отношений числа погибших насекомых к общему числу подвергшихся действию для соответствующего разведения.

Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа (38) при доверительном интервале 95 %.

Результаты . На РА из более чем 3000 колоний по морфологическим признакам отобрали 62, по цвету, форме и консистенции соответствующие В . thuringiensis . При микроскопировании было установлено, что 12 из 62 изученных изолятов образуют (наряду со спорами) кристаллы эндотоксина разной формы.

Полученные изоляты представляли собой бациллы с перитрихиальным типом расположения жгутиков. Это грамположительные факультативные анаэробы. Они формировали вегетативные клетки (одиночные или в виде коротких цепочек по 2-4 клетки) размером 2,5½0,9 мкм, хорошо росли на плотных питательных средах (мясопептонный агар МПА, картофельный агар, РА). Оптимальная температура роста — 28-30 ° С. На агари-зованных средах через 48 ч образовывали плоские колонии сероватобелого цвета, округлой или неправильной формы, мелкозернистые или шероховатые, вязкой консистенции, цвет питательной среды при этом не менялся. В клетках субтерминально располагались споры овальной формы размером 1,1-1,3½0,8-0,9 мкм (длина½ширина) и кристаллический эндотоксин (кристалл). У изолятов ¹¹ 12, 20, 40, 41 кристалл размером 1,1-1,3½0,9-1,2 мкм (длина½ширина) имел форму правильного ромба с тупыми концами и четкими гранями, у ¹¹ 15, 29, 49 наблюдали кристаллы размером 0,9-1,4½0,9-1,3 мкм (длина½ширина) правильной ромбовидной вытянутой формы, у ¹¹ 14, 25, 33, 38, 44 — неправильной формы размером 0,2-1,1½0,1-0,9 мкм (длина½ширина).

Исследование физиолого-биохимических и серологических свойств позволило классифицировать выделенные бациллы как B. thuringiensis и объединить их в три сероварианта (ВtH₁, ВtH₁₄ и ВtH_3a3b) (табл. 1).

1. Основные физиолого-биохимические свойства изолятов Вacillus thur-ingiensis (Bt) , выделенных из природных субстратов в Ленинградской области

¹ изолята	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
12	+	+		+	+	+	+	+	+	+	+
20	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
40	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
41	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
ВtН1 (эталон)	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
15	+	+	-	-	-	-	-	+	+	+	+
29	+	+	-	-	-	-	-	+	+	+	+
49	+	+	-	-	-	-	-	+	+	+	+
ВtН3а3в (эталон)	+	+	-	-	-	-	-	+	+	+	+

Продолжение таблицы 1

14	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+
25	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+
33	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+
38	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+
44	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+
ВtН14 (эталон)	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+	+

Прим еч ани е. 1, 2, 3, 4 — образование соответственно ацетилметилкарбинола, лецитиназы, пигмента, β -экзотоксина; 5 — образование пленки на мясопептонном бульоне (МПБ); 6, 7, 8, 9 — использование соответственно сахарозы, маннозы, целлобиозы, салицина; 10 — расщепление крахмала; 11 — протеолиз мясопептонного желатина (МПЖ); ВtН₁ ВtН_3а3в ВtН₁₄ — сероварианты; «+» и « - » — соответственно проявление или отсутствие проявления признака. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 %.

К сероварианту B. thuringiensis var. thuringiensis ВtH₁ были отнесены изоляты ¹¹ 12, 20, 40, 41, которые из источников азота используют пептон, мясной и рыбный бульон, дрожжи белковые кормовые , расщепляют глюкозу, маннозу, левулезу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, глицерин и салицин с образованием кислоты, не используют галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, лактозу, раффинозу, маннит, дульцит, сорбит, инулин, инозит. Это изоляты разжижали желатин, пептонизировали молоко, гидролизовали крахмал, использовали цитраты, образовывали ацетилметил-карбинол. Образование пигмента и уреазы у них не отмечали. Индол и сероводород они не использовали, редуцировали нитраты в нитриты. Давали положительную реакцию жгутикового антигена с типовой антисывороткой B. thuringiensis var. thuringiensis ВtH₁ в разведении 1:6400.

К сероварианту Bacillus thuringiensis var. kurstaki BtH_3a3b относились изоляты ¹¹ 15, 29, 49. Из источников азота они использовали пептон, мясной и рыбный бульон, дрожжи белковые кормовые, расщепляли глюкозу, левулезу, мальтозу, целлобиозу, глицерин и салицин с образованием кислоты, не использовали галактозу, арабинозу, ксилозу, маннозу, сахарозу, рамнозу, лактозу, раффинозу, маннит, дульцит, сорбит, инулин, инозит, разжижали желатин, пептонизировали молоко, гидролизовали крахмал, использовали нитраты. Синтезировали ацетилметилкарбинол. Пигмент и уреазу не синтезировали. Индол и сероводород не использовали, редуцировали нитраты в нитриты. Давали положительную реакцию жгутикового антигена с типовой антисывороткой B. thuringiensis var . kurstaki в разведении 1:6400.

Серовариант Bacillus thuringiensis var . israelensis BtH₁₄ был представлен изолятами ¹¹ 14, 25, 33, 38, 44. Из источников азота они использовали пептон, мясной бульон, рыбный бульон, дрожжи белковые кормовые, сбраживали глюкозу, мальтозу, левулезу, трегалозу, глицерин, не сбраживали сахарозу, ксилозу, лактозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, раффинозу, маннозу, дульцит, сорбит, маннит, инсулин, салицин. Не усваивали клетчатку, не расщепляли эскулин, не выделяли сероводород и уреазу. Продуцировали аммиак, ацетилметилкарбинол и лецитиназу. Восстанавливали нитраты, разжижали желатин, пептонизировали молоко, обесцвечивали лакмус. По реакции с типовой антисывороткой в разведении 1:6400 относились к серотипу B. thuringiensis var. israelensis (ВtН₁₄). Формировали кристаллический эндотоксин неправильной формы, экзотоксин не продуцировали.

Полученные данные (табл. 2) свидетельствовали о высокой технологичности изолятов ВtН1. Изоляты ¹ 12 и ¹ 41 по биологической характеристике не уступали эталону ВtН1.

Результаты оценки продуктивности и ларвицидной активности для личинок комаров изолятов ВtН14 (табл. 3) также указывали на высокую 132

технологичность и активность изолятов. Особенно следует отметить изо-ляты ¹ 33 и ¹ 44, которые по титру спор и ЛК50 для личинок комаров не уступали эталону.

• 2.    Биологическая характеристика изолятов Вacillus thuringiensis var. thur-ingiensis ВtН₁, выделенных из природных субстратов в Ленинградской области ( Х ± х )

• 3.    Биологическая характеристика изолятов Вacillus thuringiensis var . israel-ensis ВtН₁₄, выделенных из природных субстратов в Ленинградской области ( Х ± х )

¹ изолята	Титр клеток, ½109/мл	Количество экзотоксина (ЛК 50 для L 2 комнатной мухи Musca domestica ), мкл/г корма	Энтомоцидная активность (ЛК 50 для L 2 колорадского жука Lepti-notarsa decemlineata Say), %
12	2,78±0,11	3,4±0,2	0,19±0,04
20	2,58±0,13	4,0±0,2	0,26±0,04
40	2,42±0,14	4,3±0,2	0,30±0,04
41	2,61±0,10	3,8±0,2	0,19±0,04
ВtН1 (эталон)	2,68±0,11	3,7±0,2	0,19±0,04

Прим еч ани е. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 %.

¹ изолята         Титр спор, ½10⁹/мл       п ЛК 50 для L 4 комара Aedes aegypti , ½10^-3 %

14	2,65±0,13	0,25±0,03
25	2,15±0,14	0,23±0,03
33	3,12±0,12	0,17±0,03
38	2,81±0,14	0,24±0,03
44	3,28±0,13	0,16±0,03
ВtН 14 (эталон)	3,38±0,14	0,18±0,03

Прим еч ани е. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при доверительном интервале 95 %.

Продуктивность изолятов BtH3a3b (¹¹ 15, 29, 49) на дрожжеполисахаридной среде варьировала от 1,85±0,15 до 2,15±0,14 млрд спор/мл. Энтомоцидная активность для изолятов ¹¹ 15, 29 и 49 составляла соответственно 0,88±0,04; 0,82±0,04 и 0,92±0,04 % при ЛК50 эталонного штамма 0,86±0,04 %.

Таким образом, наши исследования подтверждают устоявшееся мнение о том, что энтомопатогенные кристаллообразующие бациллы Bacillus thuringiensis (Bt) встречаются повсюду — в почве, воде, лесной подстилке, трупах насекомых, в местах обитания насекомых. Идентификация и биотестирование показали, что выделенные разновидности, относящиеся к серовариантам BtH₁, BtH₁₄, BtH_3a3b, по биологическим свойствам и практической значимости близки к типовым штаммам. Очевидно, что с помощью аналитической селекции, подбора питательных сред и режимов культивирования можно усилить ценные в практическом отношении свойства выделенных Bt и с успехом использовать их в качестве продуцентов биопрепаратов для контроля численности вредных насекомых.