Бактериальные микроорганизмы, ассоциированные с тканями растений в культуре in vitro: идентификация и возможная роль

Эффективная стерилизация растительных эксплантов и соблюдение правил антисептики не исключают присутствия в in vitro культурах так называемых скрытых (эндофитных) бактерий. Роль этих бактерий в культурах тканей мало изучена, однако ее, например, связывают с регенерационной способностью эксплантов и возможностью трансформировать культивируемые in vitro клетки животных и человека. Бактериальные штаммы, патогенные для человека, могут устойчиво сохраняться в пассируемых культурах и в растениях ex vitro. Расширение среды обитания бактерий создает экологические и генетические риски, которые определяют необходимость тщательного мониторинга эндофитных сообществ в растениях, употребляемых в пищу в сыром виде, а также при применении in vitro технологий в практическом растениеводстве и для получения продуктов питания. Идентификация бактериальных микроорганизмов, колонизирующих in vitro культуры растений, дает возможность изучать влияние бактерий на хозяина, проводить направленную химиотерапию, создавать банк данных микроорганизмов, ассоциированных с культурой растительных тканей. Наиболее распространены два метода идентификации - традиционный, более доступный, но не позволяющий выявлять некультивируемые формы (он основан на использовании культуральных и морфологических характеристик, а также химических и биохимических реакций), и молекулярно-генетический. В последнем случае с использованием метагеномной ДНК и соответствующих специфических праймеров определяют различные последовательности 16S-рРНК, имеющие как консервативные сайты, одинаковые у всех прокариотов, так и пригодные для идентификации видоспецифичные участки. Внутренние транскрибируемые спейсеры (internal transcribed spacers - ITS) преимущественно применяют для различения микроорганизмов на уровне видов и даже штаммов. Таксономический состав бактериальных эндофитов свидетельствует об их разнообразии и отсутствии специфического набора в in vitro культурах растений разной систематической принадлежности и в эксплантах, относящихся к разным органам растения. Среди идентифицированных эндофитных бактерий выявлены потенциально полезные для интактных растений, в частности Streptomycete, Pantoea agglomerans и др., а также патогенные для человека, например Ralstonia mannitolytica, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium amycolatum, Bacillus neonatiensis, Salmonella и Nocaridia spp. При in vitro культивировании растительных объектов длительное бессимптомное присутствие бактерий обусловлено, с одной стороны, подавлением их роста факторами, сопровождающими культивирование растительных эксплантов (pH, температура ниже оптимума для роста бактерий, активирование защитных механизмов), с другой - одновременным поддержанием жизнедеятельности бактерий за счет экссудатов, выделяемых растительным эксплантом. Быстрая пролиферация бактериальных клеток может наступить даже при небольших изменениях первоначальных условий, при увеличении концентрации растительных экссудатов и вследствие собственно in vitro культивирования как стресса в отсутствие регулирующей роли целого организма. По мере увеличения числа пассажей доля растительных культур со скрытой бактериальной контаминацией возрастает. Имеются данные, что при этом некультивируемые эндофиты могут приобретать статус культивируемых. Скрытые бактериальные контаминации способны угнетать регенерацию, микроклональное размножение, вызывать гибель культивируемых in vitro растительных объектов, служить препятствием для воспроизводимости протоколов и иметь отношение к появлению эпигенетических сомаклональных вариантов. Так, фильтраты изолятов Acinetobacter и Lactobacillus plantarum, выделенных из деградирующих каллусов, при инокуляции в экспланты или добавлении в питательную среду резко снижали регенерацию побегов, а бактерии Mycobacterium obuense и M. aichiense угнетали развитие семян в культуре in vitro. Акцентируется проблема получения гнотобиотических растительных культур (в частности, в in vitro коллекциях генетических банков растений), обусловленная сложностью выявления и элиминации бактериальных микроорганизмов.