Бактериальные микроорганизмы, ассоциированные с тканями растений в культуре in vitro: идентификация и возможная роль

При работе с культурой растительных тканей in vitro наличие бактериальной контаминация в значительной степени определяется качеством стерильности (1, 2). Однако эффективная стерилизация растительных эксплантов и соблюдение правил антисептики не исключают присутствия в культурах in vitro скрытых бактерий (без визуально наблюдаемого роста и специфических симптомов) (3-5). Бактериальные микроорганизмы, естественным местом обитания которых служит воздушная среда, почва, растения и человек, детектируют и идентифицируют с помощью микробиологических, молекулярно-генетических и биохимических методов как в длительно пассируемых, так и в инициируемых in vitro растительных культурах (6-14). Скрытые бактериальные инфекции, обозначаемые многими исследователями как внутренние, или эндофитные, выявляют в культивируемых in vitro каллусах, микрорастениях, а также в различных типах эксплантов — в верхушках побегов, почках, меристемах (15-22). Бактериальные эндофиты, которые выполняют ряд функций, важных для растений, были и остаются предметом многочисленных исследований (23). В то же время роль эндофитных бактерий в культурах тканей менее изучена, однако она представляет интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте. В частности, бактериальные эндофиты рассматриваются в качестве ключевого фактора, определяющего регенерационную способность эксплантов наряду с генотипом и условиями культивирования (18). Их изучают как возможный перспективный источник новых компонентов для использования в практической микробиологии и медицине (24). Внимание к бактериальным эндофитам обусловлено также накоплением данных, указывающих на условность исторически сложившегося разделения микроорганизмов на фитопатогенные, патогенные для животных (человека) и непатогенные (25). Показано, что патогенные бактериальные штаммы человека могут устойчиво сохраняться в пассируемых культурах и в растениях ex vitro (14), а бактерии Agrobacterium tumefaciens способны трансформировать культивируемые in vitro клетки человека (26) и эмбрионы морских ежей (27). Расширение среды обитания бактерий создает экологические и генетические риски, которые определяют необходимость тщательного мониторинга эндофитных сообществ, особенно в тех растениях, которые человек употребляет в пищу в сыром виде (14, 28). Эта проблема актуальна и для культуры тканей растений, поскольку in vitro технологии находят широкое применение в практическом растениеводстве и получении продуктов питания.

Цель настоящего обзора заключалась в сборе и систематизации данных, касающихся выявления, идентификации, состава, динамики, возможной роли и элиминации скрытых бактериальных контаминаций в культуре тканей растений.

Бактериальные микроорганизмы, присутствие которых в культивируемых in vitro растительных объектах не сопровождается визуальными проявлениями и специфическими симптомами, в литературе обозначают как латентные, скрытые, эндогенные, внутренние, эндофитные, нередко используя эти термины как синонимы. Наиболее часто такие бактериальные микроорганизмы в культуре тканей растений называют латентными. В одной из работ (29) подчеркивается, что термин «латентный» заимствован из фитопатологии, где он применяется для описания бессимптомных патогенов, в то время как бактериальные микроорганизмы в культуре растительных тканей не обязательно патогенны (их влияние может быть отрицательным, положительным или отсутствовать). Автор цитируемой работы (29) наряду с другими исследователями (30, 31) считает более целесообразным использовать для указанных бактериальных микроорганизмов термин «скрытые». Скрытые бактериальные микроорганизмы многие иссле- дователи называют эндофитами на основании их наличия в культуре растительных объектов, прошедших поверхностную стерилизацию. Мы будем употреблять термин «эндофитные бактерии» в соответствии с его применением авторами цитируемых работ.

Согласно широко используемому определению, эндофиты — это микроорганизмы, которые, не вызывая симптомов болезней, в течение части или всего жизненного цикла обитают внутри растения (32). В природе они поступают в растение через устьица, поранения, корневую систему. Существенную роль в формировании эндофитной микрофлоры играет передача микроорганизмов через семена, а также их интродукция векторными организмами — беспозвоночными или грибами (28, 32). Интродуцированные микроорганизмы могут включаться в состав микрофлоры растения в точке вхождения и(или) распространяться по всему растению (32), при этом облигатность не служит обязательным условием (33).

Эндофитные бактерии обнаружены в цитоплазме клеток, межклеточном пространстве (34) и в сосудистой системе (35) растений. В ряде работ присутствие эндофитных микроорганизмов в культивируемых in vitro растительных объектах показано с помощью световой и электронной микроскопии, в том числе с использованием метода in situ гибридизации (15, 16, 21, 36-38).

Источники бактериальной микрофлоры. Эндофитные бактерии происходят от эпифитных бактериальных ассоциаций ризосферы и фитосферы растения. Основной источник эндофитной бактериальной микрофлоры в культурах растительных тканей — экспланты исходных растений. Асептические экспланты для культуры in vitro сложно получить от растений с розеточной формой роста, древесных, многолетних (12, 38), произрастающих в сырых местах, собранных в период влажной и теплой погоды, больных растений (21, 39), а также при использовании подземных органов (корней, корневищ, клубнелуковиц) (40, 41), почек (из-за плотного и многослойного листового футляра), эпидермальных тканей, особенно с волосками на поверхности (42, 43). При стерилизации растительного материала некоторая часть бактериальных эпифитов может оставаться в недоступных для дезинфицирующих растворов местах, таких как закрытые устьица, складки поверхности корневых черенков, пространства между эпидермальными клетками (5, 9).

К источникам системной бактериальной инфекции в культуре тканей растений могут быть отнесены также рабочее место, оператор, инструменты, посуда (2, 44). Споры некоторых бактерий сохраняются при автоклавировании (36) и долго остаются жизнеспособными в этиловом спирте (37).

Методы выявления и идентификации бактерий. Для выявления и идентификации скрытых бактериальных контаминаций используют питательные среды и физиологические тесты, методы, основанные на применении фагов, профилировании жирных кислот и белков, а также типирование генотипов с помощью MALDI TOF (Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight) масс-спектрометрии и молекулярногенетических маркеров (RAPD-PCR — random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction, REP-PCR — repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction, AFLP — amplified fragment length polymorphism, ARDRA — amplified ribosomal DNA restriction analysis, 16S-rRNA). Указанные приемы специфичны при мониторинге на разном таксономическом уровне. Так, большинство из них позволяет определить бактериальные микроорганизмы на уровне семейства, рода и вида, но для аттрибутирова- ния подвидов, биоваров и штаммов предпочтительнее использовать современные биохимические и молекулярно-генетические методы (45).

Наиболее широко применяют два способа выявления и идентификации бактерий. Один из них, традиционный, основан на использовании культуральных и морфологических характеристик, а также химических и биохимических реакций (46). Он более доступен и не требует дорогостоящего оборудования, однако не позволяет выявить некультивируемые, то есть не метаболизирующие субстрат питательных сред, формы бактерий. Второй метод, молекулярно-генетический, базируется на анализе генов, кодирующих эволюционно консервативные рибосомальные РНК, поскольку эти гены присутствуют во всех бактериальных клетках и родоспецифичны для большинства микроорганизмов (23). Для идентификации се-квенируют последовательности рибосомальных генов, кодирующих 23S-рРНК большой субъединицы (длина ~ 3000 п.н.) и 16S-рРHК малой субъединицы ( ~ 1500 п.н.), а также участки внутренних транскрибируемых спей-серов (internal transcribed spacers — ITS) (47). Часто определяют различные последовательности 16S-рРHК, имеющие как консервативные сайты, одинаковые у всех прокариотов, так и пригодные для идентификации видоспецифичные участки (48, 49). Еще более информативны последовательности рибосомальных спейсеров 16S—23S-рРHК, значительно более вариабельные по размерам и структуре по сравнению с районами самих генов. Поэтому внутренние транскрибируемые спейсеры преимущественно используют для различения микроорганизмов на уровне видов и даже штаммов (50). Для амплификации фрагментов генов 16S-рРHК и ITS регионов осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с метагеномной ДНК и соответствующими специфическими праймерами (13, 51, 52). Полученные продукты секвенируют и проводят поиск гомологичных последовательностей с помощью базы данных GenBank (53) для таксономической идентификации бактерий в исследуемом материале. В публикации А.В. Пиневича (54) упоминается о секвенировании геномов 60 видов бактерий, в то время как общее число описанных бактериальных видов составляет 5007.

Идентификация бактерий. Идентификация микроорганизмов, колонизирующих in vitro культуры растений, дает возможность изучать влияние бактерий на хозяина, проводить направленную химиотерапию, создавать банк данных по микроорганизмам, ассоциативным с культурой растительных тканей. В ранних работах для идентификации в основном применяли тесты классической микробиологии — определение способности бактериальной культуры к росту на питательных средах разного состава, окраска по Граму, морфология и цвет колоний (4, 6, 9, 10, 46). Современные методы позволяют существенно дополнить информацию о таксономическом разнообразии бактерий, ассоцированных с культурой тканей растений. База данных по таким микроорганизмам стремительно увеличивается. В таблице приведен таксономический состав бактериальных эндофитов в in vitro культурах для сравнительно ограниченной выборки исследованных растений, свидетельствующий о разнообразии форм, способных колонизировать ткани в культуре in vitro — нише, в которой условия резко отличаются от природных. При этом отмечается отсутствие специфического состава эндофитных бактерий в in vitro культурах растений разной систематической принадлежности и в эксплантах, относящихся к разным органам растения. Такой же вывод можно сделать, анализируя данные по идентификации бактерий в культурах тканей, полученные в более ранних исследованиях (4, 6, 9, 10).

Среди идентифицированных эндофитных бактерий выявлены потенциально полезные для интактных растений, в частности Streptomycete , Pan-toea agglomerans и др., а также патогенные для человека, например Ralstonia mannitolytica , Staphylococcus epidermidis , Corynebacterium amycolatum , Bacillus neonatiensis , Salmonella и Nocaridia spp. (13).

Динамика экспрессии бактерий. Длительное бессимптомное присутствие бактерий в in vitro растительных культурах обеспечивается двумя противоположными процессами — ограничением роста и поддержанием жизнедеятельности этих микроорганизмов. Рост подавляется факторами, сопровождающими культивирование растительных объектов: pH (подкисление питательной среды), температура (25 ° С) ниже оптимума для роста бактерий, возможное активирование механизмов, обусловливающих устойчивость растительных культур к бактериям (55). В то же время жизнеспособность бактериальных микроорганизмов в культуре растительных тканей поддерживается за счет экссудатов, выделяемых эксплантом, так как большинство бактерий, несмотря на гетеротрофный тип питания, не могут надежно существовать в отсутствие растительного материала (12, 55). В результате сохраняется некоторый невысокий титр бактерий, ассоциированных с культурой тканей растений, с чем связана бессимптомность и трудно искореняемое длительное присутствие микроорганизмов (персистентность).

Быстрая пролиферация бактериальных клеток может наступить даже при небольших изменениях первоначальных условий — вследствие повышения температуры окружающего воздуха, изменения кислотности или состава питательной среды, например в результате поступления дополнительного азота из отмирающих тканей экспланта (55, 56), а также при субкультивировании старых культур на питательной среде с высокой концентрацией цитокининов (8, 57). Размножение бактерий индуцируется увеличением концентрации экссудатов, выделяемых растительными культурами in vitro, которое, в свою очередь, может стимулироваться повышением температуры окружающей среды, увеличением плотности in vitro культур, переносом их на питательную среду для укоренения (55). В результате быстрого размножения бактериальных микроорганизмов возможно появление видимых симптомов в in vitro культурах и(или) видимого роста на среде культивирования эксплантов (3). Выход бактериальных микроорганизмов из культивируемых тканей в толщу питательной среды, как правило, сопровождается образованием в ней мутного ореола, отмеченного многими исследователями (7, 10, 11, 58, 59). В отсутствие регулирующей роли целого организма бесконтрольное размножение эндофитов в культуре тканей растений может стимулироваться собственно in vitro культивированием как фактором стресса (16).

В ряде работ показано, что по мере увеличения числа пассажей доля растительных культур с видимой бактериальной контаминацией уменьшается, со скрытой — возрастает. При этом может происходить изменение состава микроорганизмов, увеличение числа грамположительных форм и способности бактерий к культивированию (4, 13, 21). Так, в пассируемой культуре индивидуальных микрорастений банана показано существование бактериальных эндофитов, которые в первых трех пассажах были некуль-тивируемыми и выявились только методом секвенирования гена 16S-рРНК (бактерии VBNC — viable but nonculturable). Однако в последующих пассажах (с 4-го до 18-го) в этих же микрорастениях выявились культивируемые бактерии (13, 21). Авторы цитируемых работ полагают, что по мере возрастания числа пассажей растительных культур содержащиеся в них

VBNC эндофиты могут приобретать статус культивируемых.

Влияние бактерий на колонизируемые ими растительные культуры in vitro. Бактериальные микроорганизмы, ассоциированные с культурой растительных тканей, способны отрицательно влиять на регенерационную способность каллуса, клеточных суспензий и протопластов (56, 38), угнетать микроклональное размножение, рост и укоренение побегов, вызывать гибель культивируемых in vitro и ex vitro растительных объектов (3, 11, 13, 21, 29, 36, 37, 57, 60). Скрытые бактериальные контаминации в растительных культурах могут служить препятствием для воспроизводимости протоколов (29) и иметь отношение к появлению эпигенетических сомаклональных вариантов (61). Одна из вероятных причин негативного влияния скрытых бактериальных микроорганизмов — повышение их титра. Такая возможность рассматривается некоторыми авторами в связи с гибелью растительных культур после 2-го или 3-го субкультивирования (18, 62). В своих исследованиях мы также отмечали, что 2-й и 3-й пассажи — критические для микроразмножения введенных в культуру in vitro эксплантов малины (59). Угнетающее действие бактерий на in vitro растительные объекты может быть также связано с изменением кислотности питательной среды или ее состава под влиянием бактерий (потребление сахарозы, образование гербицидных субстанций) (63).

Особый интерес представляют работы по изучению влияния аксе-нических бактериальных культур на in vitro растительные объекты. Показано, что фильтраты культур Acinetobacter и Lactobacillus plantarum , выделенных из деградирующих каллусов растений, при инокулировании в растительные экспланты или добавлении в питательную среду резко снижали регенерацию побегов у каллусов (56, 63). Бактерии Mycobacterium obuense и M. aichiense угнетали развитие семян в культуре in vitro (38).

Полезную роль эндофитных микроорганизмов в in vitro культурах растений начали исследовать позднее, и эти данные менее многочисленны. В ряде работ отмечен позитивный эффект бактерий рода Methylobacte-rium на индукцию органогенеза и эмбриогенеза (15, 17, 64-68). Предполагается, что выявленные методом in situ гибридизации в культуре тканей сосны эндофиты Mycobacterium sp., Methylobacterium spp., Pseudomonas spp., Rhodotorula minuta могут иметь положительное влияние на морфогенез в культуре in vitro (17) по аналогии с действием бактерий на развивающиеся ткани животных (69). Показано стимулирующее влияние Bacillus circulans на соматический морфогенез у герани ( Pelargonium х hortorum Bailey) (70).

Таким образом, бактериальные микроорганизмы, ассоциированные с тканями растений в культуре in vitro, могут оказывать на них как позитивные воздействия, так и играть роль факторов, лимитирующих рост и жизнедеятельность.

В генетических банках растений основное требование к in vitro и криоколлекциям растений заключается в отсутствии внутренней микрофлоры. Гнотобиотический статус сертифицированного растительного материала позволяет избежать переноса скрытых инфекций при использовании технологий микроразмножения и служит критерием надежного сохранения генотипов в контролируемых условиях среды. Для сертификации растительного материала в нем проводят выявление, идентификацию и элиминацию основных вирусов, микоплазм и всей бактериальной микрофлоры (39). Разнообразие, многочисленность и динамическое состояние бактерий в in vitro растительных культурах создают необходимость периодического тестирования растительного материала на присутствие бактерий

Эндофитные бактерии, выявленные в in vitro культуре тканей растений

Род, вид (сорт растения) Тип культур (продолжительность культивирования in vitro) Род, вид бактерий (частота обнаружения, %) Ссылка Chrysanthemum (Arka Swarna) Микрорастения (1-7 пассажей) Различные морфотипы Curtobacterium citreum (8) Pinus sylvestris Каллусная культура Hormonema dematioides (isolates L, M), Methylobacterium extorquens (isolate F), Pseudomonas synxantha (isolates G, H, J), Pseudomonas sp. (isolates K, N), Rhodotorula minuta (isolate T) (16) Pinus sylvestris Каллусная и суспензионная культуры Methylobacterium extorquens (18) Prunus cerasus Микрорастения Pseudomonas aeruginosa (19) (Montmorency) Bactris gasipaes Микрорастения Brevibacillus sp., Moraxella sp. (20) Musa sp. Микрорастения (длительное микроклонирование) Alcaligenes, Bacillus spp., Brachybacterium, Brevibacterium, Brevundimonas, Corynebacterium, Enterobacter, Klebsiella, Kocuri, Methylobacterium, Microbacterium, Oceanobacillus, Ochrobactrum, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Staphylococcus, Tetrasphaer spp. (21) Musa sapientum Верхушки побегов Грамположительные: Bacillus megaterium, (22) (Chini champa) (1-2 нед культивирования) Cellulomona uda, C. flavigena, Corynebacterium paurometabolum Грамотрицательные: Erwinia cypripedii, Klebsiell sp., Pseudomonas sp. Larix, Picea Суспензионная культура (6-8 нед культивирования) Acinetobacter (56) Chrysanthemum (Arka Ravi) Микрорастения Enterobacter, Methylobacterium spp., Ralstonia (57) Rubus idaeus, Fragaria ananassa, Cerasus vulgaris, Ribes nigrum Микрорастения из коллекции in vitro Arthrobacter (23,5 %), Bacillus (51,5 %) Реже встречаются Agrobacterium, Bacterium, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas (58) Jatropha curcas Листовые экспланты Enterobacter ludwigii (62) Fragaria ananassa (Camarosa, Sweet Меристема 17 бактериальных штаммов из родов Bacillus, Sphingopyxis, Virgibacillus (64) Charlie, Oso-Grande) Musa sp. Верхушки побегов Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus, Staphylococcus spp., Virgibacillus; Actinobacteria (Cellulomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Kocuria spp.); a-proteobacteria (Paracoccus sp.); Y-proteobacteria (Acinetobacter spp., Pseudomonas) (51) Ilex dumosa Сегменты узлов побега Achromobacter, Stenotrophomonas maltophilia (71) Echinacea Микрорастения Acinetobacter, Bacillus, Pseudomonas, Steno-trophomonas, Wautersia (Ralstonia) (72) Carica papaya Верхушки побегов Agrobacterium (A. tumefaciens), Bacillus (B. benzoevorans), Brevundimonas (B. aurantiaca), Enterobacter (E. cloacae), Methylobacterium (M. rhodesianum), Microbacterium (M. esteraromaticum), Pantoea (P. ananatis) (70 %), Sphingomonas, Wautersia (Ralstonia) (73) Potato Микрорастения Bacillus pumilus (74) Carica papaya Верхушки побегов (1 мес культивирования) Lysinibacillus fusiformis, Paenibacillus sp., Pantoea sp., Ralstonia mannitolilytica, Sphin-gomonas sp. (75) Limonium simuatum Микрорастения Alcaligenes sp., Pasteurella multocida, Stenotrophomonas maltophilia (76) Ananas comosus Микрорастения (5 лет культивиро- Actinobacteria, Alphaproteobacteria, вания)                             Betaproteobacteria (77) Piper nigrum, Piper Каллусная культура (первичные Aminobacter, Flavobacterium, Morococcus, (78) colubrinum, Taxus baccata subsp. wallichi- экспланты) Paracoccus Pseudomonas, Psychrobacter, Rhizobacter ana, Withania somnifera и использования разных методов для их выявления. Это представляет определенную сложность при работе с большими in vitro коллекциями в генетических банках растений.

Антибактериальная терапия . Для элиминации бактериальных микроорганизмов применяются антибиотики (79). Описание и свойства некоторых антибиотиков, применяемых для химиотерапии растений, приведены в обзоре G. Seckinger с соавт. (80). Идеальные антибиотики, рекомендуемые для элиминации бактерий в культуре растительных тканей, должны быть бактерицидными, недорогими, нетоксичными для человека, растворимыми в питательных средах и не изменять их pH (9, 61). Результативность выбора наиболее эффективных антибиотиков (с широким спектром действия или в специфической комбинации) повышается при идентификации бактерий в культивируемых in vitro растительных объектах. В случае использования комбинации антибиотиков (особенно при их синергетическом действии) снижается риск возникновения устойчивости к ним у бактерий, однако некоторые антибиотики химически несовместимы и в сочетании могут нейтрализовать действие друг друга (71, 72). Грамотрицательные бактерии (они составляют большинство среди идентифицированных в культуре растительных тканей) особенно трудно поддаются элиминации из-за фактически двойной клеточной мембраны, затрудняющей проникновение многих антибиотиков. После применения антибактериальной терапии растительный материал необходимо тестировать на присутствие бактерий на протяжении 2-3 пассажей (71).

Использование антибиотиков в культуре растительных тканей объективно осложняется различными причинами. Так, необходим подбор эффективного антибиотика в бактерицидной для конкретного бактериального организма концентрации и оценка влияния антибиотика на in vitro культивируемый растительный объект; неизбежно появление бактериальных штаммов, резистентных к применяемому антибиотику; антибиотики вызывают повреждение хлоропластов и митохондрий, что проявляется в хлорозе и морфологических изменениях эксплантов (6, 9). Успехи антибактериальной терапии в культуре тканей растений в значительной степени будут определяться развитием исследований в этой области и разработкой новых классов антибиотиков.

Итак, таксономическое разнообразие скрытой (эндофитной) бактериальной микрофлоры в in vitro растительных культурах велико и может включать формы как с отрицательным, так и с положительным влиянием на колонизируемые ими растительные объекты. По мере культивирования растительного материала может изменяться титр, состав бактериальных ассоциаций, способность к культивированию. Проблема получения гното-биотических культур (в частности, в in vitro коллекциях генетических банков растений) связана со сложностью выявления и элиминации бактериальной микрофлоры.

Авторы выражают глубокую благодарность Т.А. Гавриленко (Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова) и В.И. Сафроновой (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии) за ценные замечания при обсуждении материала, изложенного в статье.