Бактерицидное влияние нанокомпозитов серебра на Clavibacter michiganensis ssp. Sepedonicus

Известно, что серебро обладает бактерицидным эффектом (Рушинская и др ., 1976; Потапченко и др ., 1985; Березняков, Страшный, 1997; Humberto et al. , 2010). Такое свойство серебра находит применение в медицине для стерилизации различных инструментов и совершенно не рассматривается для защиты культурных растений от патогенов. Существует большое количество бактериальных фитопатогенов, приводящих к значительным потерям урожая, средства борьбы с такими бактериями не эффективны. Примером такого микроорганизма является возбудитель кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum ( Cms ) (Eichenlaub, Gartemann, 2011). В настоящее время одним из перспективных направлений химического синтеза является создание антибактериальных препаратов на основе наночастиц серебра (Chen, Schluesener, 2008), стабилизированных природными и синтетическими полимерами. Наночастицы серебра плотно упаковываются в полисахаридную матрицу. Применение таких нанокомпозитов представляется удобным и безопасным для растения, а также с помощью них осуществляется адресная доставка веществ в бактериальную клетку фитопатогена.

Цель настоящей работы - исследование влияния нанокомпозита серебра на возбудитель кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum .

MATERIALS AND METHODS

Исследования проводились на бактериях Cms штамм Ас 14 05, получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Москва). Бактериальную культуру выращивали на скошенной агаризованной среде, содержащей диализат дрожжевого экстракта («Sigma», США) 10 г/л, глюкозу 15 г/л, агара-агар («Биотехновация», Россия) 10 г/л, 5 г/л СаСО3 («Реахим», Россия), рН 7,0. Бактерии культивировали в термостате, в темноте при температуре 25ºС.

В настоящей работе нами были использованы нанокомпозиты (наночастицы серебра, стабилизированные арабиногалактаном), а также их предшественники (арабиногалактан и нитрат серебра), разработанные и синтезируемые в Иркутском институте органической химии им. А.Е. Фаворского СО РАН. Все нанокомпозиты хорошо растворимы в воде и удобны в использовании.

Для экспериментов бактерии культивировали в физиологическом и водном растворе с добавлением следующих агентов: арабиногалактан, нанокомпозит (Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 2,9%), нанокомпозит (Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 4,7%) , нитрат серебра.

Бактерии с добавленными агентами инкубировали в аэростатных условиях (качалка, 80 об./мин) при температуре 25 ºС, в темноте. Спустя 1 и 6 ч после обработки производили высев бактериальной суспензии на твердую среду, через 7 суток контролировали количество колониеобразующих единиц (КОЕ, кл/10 мкл).

Для определения скорости дыхания клетками, 2-х суточные бактерии Cms инкубировали с нанокомпозитами 6 ч в аэростатных условиях. Далее 1,4 мл суспензии клеток в среде вносили в термостатируемую полярографическую ячейку и, используя платиновый электрод закрытого типа (электрод Кларка), на полярографе ОН-105 (Венгрия) (Трушанов, 1973) регистрировали скорость поглощения кислорода при 26 оС. Скорость поглощения кислорода выражали в нмоль поглощенного кислорода в минуту на 1000 клеток, учитывая растворимость кислорода в воде (Трушанов, 1973).

Полученные результаты были статистически обработаны с использованием пакета программ MS Excel.

RESULTS AND DISCUSSION

Опыты по влиянию серебросодержащих нанокомпозитов на Cms проводили с использованием растворов с одинаковым содержанием серебра. В качестве среды культивирования бактерий применяли дистиллированную воду и питательную среду. Время культивирования на дистилляте было выбрано 1 ч, а на питательной среде – 6 ч.

Согласно полученным результатам, спустя 1 ч культивирования Cms в водном растворе нитрата серебра наблюдали полную гибель бактериальных клеток (рис. 1). Также при культивировании на дистиллированной воде проявлялось токсическое действие серебросодержащих нанокомпозитов, но нанокомпозит с содержанием серебра 2,9% обладал слабым токсическим эффектом, в то время как Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 4,7% вызывал уже полную гибель клеток.

При культивировании Cms на питательной среде в присутствии действующих веществ не наблюдалось токсического действия обоих нанокомпозитов (рис. 2).

Нитрат серебра на питательной среде оказывал токсический эффект, но он был несколько ниже, чем в эксперименте с культивированием патогена на дистилляте (рис. 1).

Таким образом, при культивировании Cms на питательной среде токсический эффект нанокомпозитов не наблюдался, но при культивировании на обедненной среде (дистиллированная вода) их токсичность была хорошо заметна. Это объясняется тем, что на обедненной питательной среде отсутствовали источники углевода и бактерии активно поглощали нанокомпозиты, состоящие из арабиногалактановой оболочки. В результате чего, наночастицы серебра также проникали в бактериальные клетки, вызывая их гибель. В питательной среде в качестве источника углевода имеется глюкоза, которая легкодоступна для бактерий, поэтому Cms в меньшей степени поглощали нанокомпозиты.

Для выявления механизма подавления нанокомпозитами серебра бактерий нами было изучено изменение интенсивности поглощения кислорода клетками Cms после обработки нанокомпозитами. Полученные результаты представлены на рис. 3. Показано, что углеродный предшественник нанокомпозитов – арабиногалактан несколько стимулировал поглощение кислорода клетками. Выявлен подавляющий эффект на дыхание у нанокомпозита с содержанием серебра 4,7% и предшественника нанокомпозита – нитрата серебра.

Figure 1. Колониеобразующая способность бактериального патогена после обработки (1 час) водными растворами нанокомпозитов и их предшественников в дистиллированной воде, с концентрацией действующего вещества 0,00145% (в пересчёте на элементарное серебро), титр бактерий 3·10 ⁸ кл/мл, разведение 10^-6.

К – контроль, 1 – арабиногалактан, 2 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 2,9%,3 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 4,7% , 4 – нитрат серебра.

Figure 2. Колониеобразующая способность Cms после шестичасовой обработки водными растворами нанокомпозитов и их предшественников в питательной среде, содержащими 0,00145% серебра (в пересчёте на элементарное серебро), титр бактерий 1,8·10⁸ клеток/мл, разведение 10^-6.

К – контроль, 1 – арабиногалактан, 2 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 2,9%,3 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 4,7% , 4 – нитрат серебра.

Figure 3. Колониеобразующая способность бактериального патогена после обработки (1 час) водными растворами нанокомпозитов и их предшественников в дистиллированной воде, с концентрацией действующего вещества 0,00145% (в пересчёте на элементарное серебро), титр бактерий 3·10⁸ кл/мл, разведение 10^-6.

К – контроль, 1 – арабиногалактан, 2 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 2,9%,3 – Ag-арабиногалактан с содержанием серебра 4,7% , 4 – нитрат серебра.

Обобщая полученные данные, можно сделать заключение, что при выращивании Cms на бедной среде (дистиллированная вода) проявляется высокий уровень токсичности нанобиокомпозитов, что связано с активным поглощением бактериальными клетками арабиногалактана, из которого после расщепления и усвоения полисахарида высвобождается действующий агент и убивает клетки. Эта гипотеза подтверждается тем, что при выращивании на богатой питательной среде бактерицидное действие нанокомпозитов уменьшается. Проведенные исследования позволяют предполагать, что снижение КОЕ Cms после обработки нанокомпозитами может быть связано с подавлением дыхания бактерий. Таким образом, подтверждается функциональная роль прикрепления серебра на арабиногалактановый носитель с целью более успешной доставки агента в бактериальную клетку.

ACKNOWLEDGMENT